琼脂糖微球

琼脂糖微球 

    琼脂糖（Agarose）是纯化的线性半乳聚糖亲水胶体，提取自琼脂或者含琼脂的海藻，结构上是一种线性聚合物，由β-D-吡喃半乳糖（1-4）连接3,6-脱水α-L-吡喃半乳糖基构成。作为一种凝胶试剂，常用于通过凝胶电泳或者印迹法（如Northern或Southern）来进行日常核酸分析，也适用于蛋白应用，如辐射状免疫扩散（RID）实验。

本品为3:1 琼脂糖，与常规琼脂糖相比，对PCR产物，小片段DNA（1000bp以下）具有很高的分辨率。此外，还具有如下特点：1）易溶解，胶液更清澈，可以配制高达5%的凝胶；2）很低的背景；3）品质稳定等。

琼脂糖的基本参数，包括：

1）   硫酸盐含量（sulfate content）——纯度指标，因为硫酸根是存在琼脂糖内的主要离子基团；

2）   凝胶强度（gel strength）——施加于凝胶使之断裂的外力；

3）   胶凝点（Gel point）——水溶性琼脂糖溶液冷却后形成凝胶时的温度。液体向凝胶转化的过程中，琼脂糖溶液具有滞后性，因此，胶凝点不等同于胶熔点。

4）   电渗（EEO）——液体穿透凝胶的一种电动运动。琼脂糖凝胶内的阴离子基团吸附在基质上不会发生迁移，但是解离的阳离子就会朝负极迁移，从而产生电渗。由于生物聚合物的电泳迁移通常是朝负极运动，则EEO产生的内部对流会干扰分离效率。

琼脂糖微球 

使用方法

1. 乙醇浸泡：

在室温下，将干粉浸泡于50-60%乙醇中至少24小时，并不断搅拌以保证凝胶溶胀，用无盐水洗去残存的乙醇滤干;

2.无盐水浸泡：

室温下，在无盐水中充分溶胀24小时，间隙搅拌，以保证凝胶的完全溶胀，然后；

3. 盐酸浸泡：

在常温下再用0.2N HCl浸泡12小时，间隙搅拌，滤干，水洗至中性；

4. 将溶胀好的凝胶脱气后（真空抽滤或超声波）根据装柱要求一次性置入柱内，注意保持湿态装柱，并避免柱内产生气泡或断层；

5. 上样前平衡层析柱至少3-5 个柱体积直到记录仪基线变得平稳为止（流出液的PH值等于上柱的Buffer 的PH值）；

6. 凝胶过滤的上样量一般为5%的柱床体积，我们建议初次上样控制在1-2%的床体积，视分离情况可以调整；脱盐时上样量可以达到20% 的柱床体积，柱高的选择也与分离要求相关，柱高控制在40-50cm 以下，过高的凝胶层会引起较大的反压，应当尽可能避免。难分离物质要有一定柱高和流速控制，脱盐时高径比为5：1 即可；

7. 洗脱方法：

可以用无盐水，也可以采用上柱时的缓冲液洗脱；在上柱Buffer 中加入NaCl等梯度洗脱或盐梯度洗脱也可以完全分离纯化；

8. 在位清洗（CIP）

凝胶使用十次后作一次CIP，目的是去除柱床内沉淀的及顽固残留的蛋白。方法是以40cm/h 用1M 氢氧化钠反向洗四个柱体积，再以至少三个柱体积平衡缓冲液再生。