利用质谱成像技术观察玉米根尖中的13C标记代谢物

玉米根尖是植物中生长最快的组织之一，也是植物吸收水分和养分的主要部位，具有高度的代谢活性。此外，根尖包含了多种不同的细胞类型，为研究不同类型细胞之间的代谢差异提供了机会。然而，传统的代谢途径研究主要依赖于溶剂提取匀浆中代谢物，这一过程无法有效区分不同类型细胞的代谢特性。因此本研究旨在利用质谱成像结合体内同位素标记技术，探究玉米根尖中的代谢动态，确定不同代谢物在玉米根尖不同细胞区域的具体位置，研究其代谢转化速率和路径，对进一步理解植物细胞如何在不同细胞区域中调节代谢途径具有重要意义。

本研究利用同位素标记和质谱成像技术结合的方法，探究了玉米根尖中的代谢动态。具体可分为以下4个步骤：

1）培养玉米根尖：首先，将玉米种子的根尖切割至 3mm 长，并在含有 200mM [U−¹³C] 葡萄糖或未标记葡萄糖的 0.1x Hoagland 培养基中培养5天，直至根尖生长到约 14mm 长。

2）制备样本：培养后的根尖再次被切割至 3mm 长度，然后沿纵向进行冷冻切片。

3）MALDI-MSI 分析：使用 MALDI-MSI 技术对玉米根尖的切片进行成像， 切片表面喷涂基质选用 1,5-DAN 。

4）数据分析和代谢物鉴定：通过比较 ¹²C 和 ¹³C 数据集中的质谱图，利用精确质量匹配和碳数匹配，结合代谢物数据库，对检测到的代谢物特征进行注释。

该研究首先对 ¹³C 的标记效果进行了验证，通过对比 ¹²C 和 ¹³C 标记样本的质谱数据，确认了标记的成功实施。在 ¹³C 标记的样本中，发现简单糖及其衍生物显示出完全的同位素标记，表明这些代谢物在新生长的根尖组织中是新合成的。相对地，部分小分子代谢物的标记不完全，暗示这些分子可能在新组织中经历了循环利用。为了准确地注释检测到的代谢物，研究人员匹配了 ¹³C 标记样本中的标记峰与 ¹²C 样本中的单同位素峰。同时利用自制的 Python 代码处理数据，这一方法提高了匹配的精确度。通过这种方法，初步注释了56种代谢物，涵盖了氨基酸、小有机酸、糖类和脂类等多种类型的代谢物。

该研究通过 MALDI-MSI 技术详细分析了 ¹³C 标记的玉米根尖中的氨基酸类物质。结果显示，尽管 γ-氨基丁酸（GABA）在根尖中的分布相对均匀，但蛋白质源性氨基酸如谷氨酸（Glu）、谷氨酰胺（Gln）和酪氨酸（Tyr）在分生组织区域显著富集。通过这些氨基酸的同位素体分布，能够推断出它们的代谢周转速率和生物合成途径。例如，谷氨酸和谷氨酰胺几乎完全被 ¹³C 标记，表明它们在代谢中具有快速的周转率，而其他氨基酸如赖氨酸（Lys）则显示出较高的 ¹²C 峰，暗示它们的代谢周转较慢。

研究发现脂肪酸如亚油酸和油酸在 MS 图像中显示出较高的 ¹²C 峰，表明这些脂质的代谢周转速度较慢。并且在新生长的组织中，未标记的 ¹²C 脂肪酸可能被循环利用，意味着这些脂肪酸在细胞中具有较长的半衰期或它们参与的代谢途径较为缓慢。相反，某些磷脂类代谢物，如磷脂酸（PA）和磷脂酰肌醇（PI），在组织中的 ¹³C 标记较为完全，表明它们在新合成的组织中被迅速更新，表明这些磷脂在细胞膜的生物合成和维持中可能更活跃的发挥着作用。此外，该研究还观察到脂质代谢中间体的部分 ¹³C 标记，揭示了脂质生物合成过程中中间代谢物的积累。

图4. ¹³C标记的玉米根尖中选定脂质的质谱成像图及其同位素标记分布。

该研究利用 MSIi（Mass Spectrometry Imaging of in vivo isotope-labeled metabolites）技术，成功地在细胞分辨率层面观察了玉米根尖中 ¹³C 标记的代谢物。研究发现简单糖及其衍生物在根尖中被完全标记，而一些氨基酸和脂质则显示出不同程度的标记，揭示了代谢物在根尖不同区域细胞中的分布和代谢转化速率的差异，其中脂肪酸和脂质的代谢转化较慢；并且通过分析它们的同位素标记分布，推测出了它们在生物合成过程中的代谢通量。该研究成功揭示了玉米根尖中代谢物的空间分布及其代谢周转的异质性，为理解植物细胞代谢动态提供了新的视角，也为传统的代谢组学和代谢通量分析（MFA）提供了方法补充。

   

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