关键词:MALDI-MSI 质谱成像,Mass spectrometry 质谱法,Peptides and proteins 肽和蛋白质,Plants 植物,Protein identification 蛋白质鉴定
基质辅助激光解吸电离质谱法(MALDI MS)是一种用于研究蛋白质分布的通用分析方法,已广泛用于动物(包括人类)的蛋白质组学研究,但在植物上的应用还较少。目前,只有低质量分辨率的 MALDI MS 成像技术被用于研究植物中的蛋白质,且研究的蛋白质分子量相对较小。因此,本研究以高蛋白质含量的鹰嘴豆以及含有毒性蛋白(相思子毒素)的相思子为研究对象,旨在通过 MALDI MS 成像技术对鹰嘴豆和相思子中的蛋白质进行空间定位及鉴定,以期开发一种在植物样品中实现蛋白质的空间定位及鉴定的方法,为植物蛋白质的研究提供了新思路。
2023年9月,德国拜罗伊特大学 Andreas Römpp 团队在 Analytical chemistry 发表了题目为“MALDI MS Imaging of Chickpea Seeds(Cicer arietinum) and Crab´s Eye Vine (Abrus precatorius) after Tryptic Digestion Allows Spatially Resolved Identification of Plant Proteins”的文章,该研究利用 AP-SMALDI MS 成像技术对经胰蛋白酶处理后的鹰嘴豆和相思子中的蛋白质进行空间定位及鉴定。研究人员开发了一种新的样品制备方法,并建立了一套完整的实验流程,包括样品处理、胰蛋白酶处理、质谱成像和数据分析,通过该方法,研究人员成功地在鹰嘴豆和相思子中定位和鉴定了多个蛋白质,为进一步研究植物蛋白质功能和代谢奠定了重要基础。
本研究的研究思路是通过 MALDI MS 成像技术对鹰嘴豆和相思子经胰蛋白酶处理后的蛋白质进行空间定位及鉴定,并对样品前处理方法进行了考察和优化,具体包括以下两个步骤:
对不同溶剂的浸泡效果、不同的样品清洗方案以及样品包埋剂和包埋方式进行考察,以保证检测时样品的完整性。
对 MALDI 基质以及检测条件进行优化,以获得最佳检测信号。
2.1
该研究以鹰嘴豆作为富含蛋白质的植物器官模型,介绍了用于胰蛋白酶肽的 MALDI 质谱成像的植物样品的制备方法。由于植物组织与哺乳动物组织的成分差异较大,植物种子在切片之前通常需要进行浸泡处理,文中对水、乙醇和含水乙二醇的浸泡效果进行了比较,结果发现,用水浸泡时,种子膨胀不均匀,切片时裂缝的形成会增加;当用50%乙醇进行浸泡时,样品切片会更完整,但在后续过程中,样品很容易变干和从载玻片上剥落;当用含水乙二醇进行浸泡时,样品切片更完整,在后续的过程中也更稳定,研究人员又对不同含水量的乙二醇进行了比较,发现用25-30%的乙二醇浸泡样品,得到的切片最完整和稳定。几种浸泡介质的显微镜图像如图S1所示。
接下来,该研究又对浸泡时间以及包埋剂和包埋方式进行了比较,结果发现无论何种浸泡介质,完全浸泡所需的时间都在1周左右,浸泡时间较短样品会有干心,浸泡时间较长(4周)不利于样品切片。此外,5%明胶比 CMC 更适于作为包埋介质,包埋时将胚根朝底放入包埋盒中,切片时,将种子朝向切割刀片的方向,使胚根远离刀片,可以防止胚根丢失,并获得稳定、完整的鹰嘴豆切片。该研究还对乙二醇浓度和切片厚度的相关性进行了研究,可以制备薄片(25µm)。详情见图S2。
图S1. 不同浸泡介质的代表性显微镜图像(各7天)。A:浸泡在纯去离子水中。B:用50%的乙醇浸泡。C:浸泡在30%的乙二醇中。
图S2. 不同切片厚度和乙二醇浓度的显微图像矩阵。
所有的图像在透射光模式下和 X20 的放大倍数下拍摄。
由于生物组织的复杂性,为了降低抑制作用,有效固定切片,通常采用洗涤的方式去除脂质、盐类和糖类。因此,选择合适的洗涤方案对于在有效去除干扰物质和最小化分析物离域之间实现可接受的权衡至关重要。
该研究对两种方案进行了比较,方案1:使用70%冷藏异丙醇清洗两次,每次30秒,然后使用95%冷藏异丙醇清洗15秒;方案2:使用70%和100%冷藏乙醇分别清洗30秒,并在 pH4.5 的碳酸氢铵缓冲液中浸泡5次。结果表明,第二种方案会导致一些蛋白质从切片上被洗掉,而无法检测到相应的胰蛋白酶消化产物,因此选择方案1。
由于植物组织通常倾向于吸收液体,因此很难将胰蛋白酶消化限制在样品表面。为了防止胰蛋白酶被样品吸收,需要在应用胰蛋白酶之前,进行短时间的纯水喷雾,以使植物组织饱和,从而有效降低胰蛋白酶吸收。在经纯水喷雾处理之后,立即向切片表面喷涂胰蛋白酶,然后将切片于40℃的恒温恒湿箱中放置过夜。将样品从恒温箱中移出后,需使用低 pH 值的 MALDI 基质停止胰蛋白酶的反应,该研究对比了 DHB 和 CHCA 两种基质的喷涂效果,发现使用 DHB 能够获得更高的鹰嘴豆胰蛋白酶消化产物信号,因此,选择 DHB 作为进一步测量的基质。纯水喷雾、胰蛋白酶喷雾及 DHB 喷涂参数详情见表S2。
表S2. 使用 HTX M5 喷雾器在鹰嘴豆切片上自动喷洒纯水、胰蛋白酶和 MALDI 基质 DHB 的参数。
图1. 植物蛋白 MALDI 质谱成像的样品制备工作流程。样品浸泡和水喷雾是标准样品制备方案中新引入的步骤。恒温箱和物体温度(40℃)。
2.2
鹰嘴豆中蛋白质的胰蛋白酶肽的分布情况各不相同。在图2B中,作者用红色表示 α-1 ,4葡聚糖磷酸化酶的胰蛋白酶肽 EFVR(钾离子加合物),EFVR 均匀地分布在鹰嘴豆种子中,包括种皮部分。同时,在图2C中,作者给出了单个 65μm 像素的质谱图,展示了 EFVR 在高质量分辨率(R(FWHM)= 146,706)和高质量精度(质量偏差−1.02ppm)下的信号。在图2B中,作者用绿色表示40S核糖体蛋白S4的胰蛋白酶肽 VGVIKNR(钠离子加合物),其单像素质谱如图2D所示。VGVIKNR 在子叶内呈典型的环形分布,这可能是由于子叶内的维管束或褶皱所导致。在图2E中,70kDa 热休克蛋白8的胰蛋白酶肽 SHGVK(钾离子加合物)的信号用红色表示,其主要集中在胚叶周围,子叶内的强度较低。此外,60S核糖体蛋白 L26-2 的胰蛋白酶肽 KKWVIHIER(铵根离子加合物)在图2E中用绿色表示,其仅位于子叶内。
图2. 鹰嘴豆中不同分布的胰蛋白酶肽的离子图像和质谱数据。
A:具有指定解剖特征的鹰嘴豆切片的光学图像。B:m/z 588.25426(红色),对应A0A1S2XHJ1蛋白的胰蛋白酶肽EFVR(钾离子加合物),m/z 807.48112(绿色),对应A0A1S2YYM1蛋白的胰蛋白酶肽VGVIKNR(钠离子加合物)。C:m/z 588.25426的单像素质谱图,质量分辨率为R、质量偏差和间隔宽度(红色)。D:m/z 807.48112的单像素质谱图,质量分辨率为R、质量偏差和间隔宽度(绿色)。E:m/z 565.24946(红色),对应A0A1S2YX55蛋白的胰蛋白酶肽(钾离子加合物),m/z 1225.7525(绿色),对应A0A1S2XNP5蛋白的胰蛋白酶肽SHGVK(铵根离子加合物)。F:m/z 565.24946的单像素质谱图,质量分辨率为R、质量偏差和间隔宽度(红色)。G:m/z 1225.7525的单像素质谱图,质量分辨率为R、质量偏差和间隔宽度(绿色)。
单通道质谱成像图像如图S15所示。
到目前为止,在质谱成像中没有普遍认可的蛋白质鉴定程序,该研究提出每个蛋白质至少要有两个检测肽的数量,并且具有一致的“优势”空间分布,且至少有一个肽是数据集独有的。因此,该研究又给出了三个鹰嘴豆种子中具有代表性的蛋白质对应的胰蛋白酶肽的质谱图像。在图2B(红色)中的胰蛋白酶 EFVR(K离子加合物)旁边,发现了另外四个在整个切片上分布一致的 α-1 ,4葡聚糖磷酸化酶的胰蛋白酶肽,其分布如图3A所示。在图2B(绿色)中的胰蛋白酶 VGVIKNR(钠离子加合物)旁边,还检测到40S核糖体蛋白S4的两个胰蛋白酶肽,其分布如图3B所示。此外,在子叶中还检测到了另一种与 KKWVIHIER 分布一致的60S核糖体蛋白 L26-2 的胰蛋白酶肽,详情见图3C。
图3. 三种鹰嘴豆蛋白的胰蛋白酶肽的质谱成像图。A:A0A1S2XHJ1蛋白的胰蛋白肽的质谱成像图。B:A0A1S2YYM1蛋白的胰蛋白肽的质谱成像图。C:A0A1S2XNP5蛋白的胰蛋白肽的质谱成像图。
除了检测到上述的蛋白质外,该研究还从鹰嘴豆中鉴定出16种蛋白质,其中,7种蛋白质在整个剖面上均有分布(图S10),8种蛋白质分布在子叶和胚根中,1种蛋白质仅在子叶分布(图S11)。同时还检测到大量(189个)与其他鹰嘴豆蛋白对应的附加肽,但这些蛋白质均不满足文中提出的要求(每个蛋白质要检测到两个相匹配的肽)。当使用不严格的标准鉴定蛋白质时,鉴定到的蛋白质数量会大幅增加,但假阳性率会升高。因此文中提出的方法大幅降低了质谱成像中植物蛋白鉴定的假阳性率。
图S10. 鉴定出遍布整个切片的蛋白质(除了图3A中所示的蛋白A0A1S2XHJ1)
图S11. 鉴定出分布在子叶和胚根上的蛋白质(除了图3B中所示的蛋白A0A1S2YYM1)
为了考察工作流程的可重复性,该研究对同一鹰嘴豆种子的不同切割平面上的另一个切片进行重复检测,结果与图3一致,详情见图S14。另外又在几乎相同的条件下进行了两次检测。图S15−S18中显示了图2中所示的胰蛋白酶肽的单通道离子图像。结果表明,利用该工作流程,可以根据胰蛋白酶肽对植物样品中的蛋白质进行鉴定和定位,且该方法的空间分辨率更高(~65μm),质量分辨率和质量精度也更高。
图S14. 鹰嘴豆种子的重复检测图。A:鹰嘴豆切片的光学图像。B:A0A1S2XHJ1蛋白的胰蛋白肽的质谱图像。C:A0A1S2YYM1蛋白的胰蛋白肽的质谱图像。D:A0A1S2XNP5蛋白的胰蛋白肽的质谱图像。
图S15. 鹰嘴豆切片上具有不同分布的胰蛋白酶肽的单通道质谱图像。A:鹰嘴豆切片的光学图像。B:m/z 588.25426的质谱图像,对应物质为A0A1S2XHJ1蛋白的胰蛋白酶肽EFVR(钾离子加合物)。C:m/z 565.24946的质谱图像,对应物质为A0A1S2YX55蛋白的胰蛋白酶肽SHGVK(钾离子加合物)。D:m/z 1225.75283的质谱图像,对应物质为A0A1S2XNP5蛋白的胰蛋白酶肽(铵根离子加合物)。E:m/z 807.48112的质谱图像,对应物质为A0A1S2YYM1蛋白的胰蛋白酶肽VGVIKNR(钠离子加合物)
图S16. 图S14中重复测量的胰豆酶肽的单通道MS图像。图中各部分的描述与图S15一致。
图S17. 在鹰嘴豆切片上进行不同分布的胰蛋白酶肽检测的单通道质谱图像。与其他测量只有技术差异:样品在-80℃放置过夜。图中各部分的描述与图S15一致。
图S18. 在鹰嘴豆切片上进行不同分布的胰蛋白酶肽检测的单通道质谱图像。与其他测量只有技术差异:样品在-80℃放置过夜,像素为 100μm 。图中各部分的描述与图S15一致。
2.3
相思子毒素是存在于相思子中的四种有毒高质量(~60kDa)蛋白质异构体的总称(abrin-a、abrin-b、abrin-c、和abrin-d),其中 abrin-a 具有极强的细胞毒性。该研究用同样的样品制备方式制备了相思子切片,并对 abrin-a 在相思子中的分布进行了研究。该研究采用与鹰嘴豆相同的样品前处理方式制作相思子切片,然后进行 MALDI 质谱成像,结果如图4所示。在相思子切片上可以检测到 abrin-a 独有的两种胰蛋白酶肽,分别为 IIMWKCKDR(m/z 1230.58886)的钾离子加合物,标准误差为 0.82ppm,以及 FSTEGATSQSYK(m/z 1327.57772)的钠离子加合物,标准误差为 1.35ppm,且这两种胰蛋白酶肽均匀地分布在相思子中,包括胚芽和种皮。
图4. abrin-a的质谱成像。
A:胰蛋白酶处理前切片的光学图像。B:胰蛋白酶肽IIMWKCKDR(m/z 1230.58886)的钾离子加合物离子图像。C:包含质谱质量分辨率和质量偏差的m/z 1230.58886 的单像素质谱图。D:胰蛋白酶肽FSTEGATSQSYK(m/z 1327.57772)的钠离子加合物离子图像。E:包含质谱质量分辨率和质量偏差的m/z 1327.57772 的单像素质谱图。
该研究利用 MALDI 质谱成像技术对鹰嘴豆和相思子用胰蛋白酶处理后的的蛋白质进行空间定位及鉴定,并采用严格的鉴定标准对鹰嘴豆中的16种蛋白质进行了可视化和鉴定,成功地确定了多个蛋白质的分布模式,并通过 MALDI-MS/MS 实验证实了这些结果。开发了一种新的样品制备方法,并建立了一套完整的实验流程,包括样品处理、胰蛋白酶消化、质谱成像和数据分析。与传统方法相比,这些方法可以有效地去除干扰物质,并最小化蛋白质的迁移和丢失,且经胰蛋白酶处理后再进行 MALDI 质谱成像,不受较大蛋白质分析的限制,这为植物蛋白质研究提供了一种新的途径,为进一步研究植物蛋白质功能和代谢提供了重要的基础。该研究也为农业和食品科学领域提供了一种快速、准确、高通量鉴定和研究植物种子中蛋白质的方法,有助于改良和优化农作物的品质和产量。此外,该研究还为药物研发和生物医学领域研究蛋白质在疾病治疗和药物传递中的作用提供了新思路。
文献地址:https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.3c02428
在大中华区独家代理的两款质谱成像离子源,都可搭载Thermo ScientificTM Q ExactiveTM或Obitrap ExplorisTM系列质谱仪。
AP-SMALDI 5AF高分辨自动聚焦3D快速质谱成像系统,常压操作环境,空间分辨率可达到3μm,独特3D检测模式可以检测凹凸不平的样品表面,快速检测模式可达18pixel/s,全像素检测大大提高检测灵敏度,高空间分辨率和高质量分辨率使样本中的分子化合物达到最佳成像效果。
MALDI ESI InjectorTM 透射式超高分辨质谱成像系统,可以同时搭载MALDI离子源与ESI离子源,既可用于传统LC-MS/MS实验,也可用于质谱成像检测,通过双离子漏斗接口实现离子源快速切换,无需拆卸,操作便捷,并且接口可以进一步升级为MALDI-2和t-MALDI检测,大大提高空间分辨率和检测灵敏度。
更多
利用质谱成像和体内同位素标记研究浮萍中半乳糖脂质生物合成的时空变化
厂商
2024.08.14
空间多组学:多维度解析生命的秘密
百态
2024.08.08
质谱成像(MSI):天然产物药物研发新视角
厂商
2024.07.11
利用MALDI质谱成像技术观察不同发育时期草莓中代谢物的分布
厂商
2024.07.05