柠檬酸合酶（citrate synthase，CS）试剂盒说明书

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

CS（EC 2.3.3.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中，是三羧酸循环个限速酶，是三羧酸循环主要调控位点之一。

测定原理：

CS 催化乙酰 CoA 和草酰乙酸产生柠檬酰辅酶 A，进一步水解产生柠檬酸；该反应促使无色的 DTNB 转变成黄色的 TNB，在412nm 处有特征吸光值。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水

试剂组成和配制：

试剂一：液体 25mL×1 瓶，-20℃保存； 试剂二：液体 5mL×1 瓶，-20℃保存； 试剂三：液体 0.5mL×1 支，-20℃保存；试剂四：液体 28mL×1 瓶，4℃保存； 试剂五：粉剂×1 瓶，4℃保存；

试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存，临用前加入 1.2mL 蒸馏水，用不完的试剂仍-20℃保存；

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

① 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

② 将匀浆 600g，4℃离心 5min。

③ 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。

④ 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 CS（此步可选做）。

⑤ 在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或200W，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体 CS 测定。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 412nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

（1） 在试剂五中加入 0.6mL 无水乙醇和 13mL 试剂四，混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（ 其它物种）孵育 5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

（2） 测定管：在EP 管中加入 40μL 样本、880μL 试剂五和 40μL 试剂六，混匀，37℃反

应 15min 后立即测定吸光值 A1。

（3） 对照管：在EP 管中加入 40μL 样本、880μL 试剂四和 40μL 试剂六，混匀，37℃ 反应 15min 后立即测定吸光值A2。

（4） 计算 ΔA=A1-A2，每个测定管设一个对照管。