YIJI线粒体呼吸链复合物II活性比色法定量检测试剂盒产品说明书(中文版)
主要用途
YIJI线粒体呼吸链复合物II(琥珀酸-辅酶Q还原酶)活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用合成辅酶Q同功类似物二氯酚靛酚,通过反应系统测定样品中二氯酚靛酚还原后吸光峰值的变化,即采用比色法测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于其适合于各种纯化线粒体样品(动物、人体、酵母)以及细胞或组织裂解悬液样品的琥珀酸-辅酶Q还原酶的特异性活性检测。可用于衰老、能量代谢、蛋白组学、病理生理学、神经病变等研究。产品不含污染性蛋白酶,严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定,反应优化,检测敏感。
技术背景
线粒体呼吸链复合物II,通常称为琥珀酸-辅酶Q还原酶或琥珀酸脱氢酶(Succinate-Coenzyme Q Reductase;Succinate Dehydrogenase),是线粒体电子传递链与三羧酸循环链接的载体:含有四个亚单位,包括共价结合的辅基黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide;FAD)和三个铁硫中心(Fe-S clusters),以及细胞色素b亚单位,其最特征性的酶活性是丙二酸钠敏感的琥珀酸-辅酶Q还原酶。复合物II催化琥珀酸(succinate)被氧化为富马酸(fumarate),线粒体内电子由供体FAD传递到内膜上辅酶Q受体(泛醌;ubiquinone)的能量转移反应,进行呼吸链传递。该酶异常会导致嗜铬细胞瘤(paraganglioma)、肾上腺嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma)和Leigh综合征。基于琥珀酸底物,通过琥珀酸-辅酶Q还原酶的催化,氧化为富马酸,同时氧化型二氯酚靛酚(dichlorophenal-indophenol;DCPIP)转化为还原型二氯酚靛酚(dichlorophenal-indophenol;DCPIPH2),在分光光度仪下产生吸光峰值的变化(600nm 波长),由此定量测定琥珀酸-辅酶Q还原酶的特异活性。其反应系统是:
产品内容
YIJI缓冲液(Reagent A) 毫升
YIJI反应液(Reagent B) 毫升
YIJI阴性液(Reagent C) 毫升
YIJI底物液(Reagent D) 微升
产品说明书 1份
保存方式
保存在-20℃冰箱里,避免反复冻融;YIJI反应液(Reagent B)和YIJI底物液(Reagent D),避免光照,有效保证6月
用户自备
比色皿:用于比色的容器
分光光度仪:用于比色分析
培养箱:用于孵育反应物
实验步骤
实验开始前,将-20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化;YIJI缓冲液(Reagent A)室温预热;YIJI反应液(Reagent B)和YIJI底物液(Reagent D)注意避光。然后进行下列操作。
一、 测定准备
1. 准备好待测样品(例如纯化线粒体样品等),置于冰槽里
2. 设定好分光光度仪(温度为30℃):波长为600nm,间隔60秒,读数6次(共5分钟),并置零
二、 背景对照测定
1. 移取xx微升YIJI缓冲液(Reagent A)到新的比色皿
2. 加入xx微升YIJI反应液(Reagent B)
3. 加入xx微升YIJI底物液(Reagent D)
4. 上下倾倒数次,混匀
5. 放进30℃培养箱里静置3分钟
6. 加入xx微升YIJI阴性液(Reagent C)
7. 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
8. 即刻放入分光光度仪检测,此为背景空对照:600波长读数0分钟-600波长读数1分钟或5分钟
三、 样品活性测定
1. 移取xx微升YIJI缓冲液(Reagent A)到新的比色皿
2. 加入xx微升YIJI反应液(Reagent B)
3. 加入xx微升YIJI底物液(Reagent D)
4. 上下倾倒数次,混匀
5. 放进30℃培养箱里静置3分钟
6. 加入100微升待测样品(注意:10微克总线粒体蛋白)
7. 上下倾倒数次,混匀(限定在3秒之内)
8. 即刻放入分光光度仪检测,此为样品活性读数:600波长读数0分钟-600波长读数1分钟或5分钟
四、 计算样品活性
注意事项
1. 本产品为21次操作,包括背景对照
2. 操作时,须戴手套
3. YIJI反应液(Reagent B)含有毒性物质,避免直接用手接触
4. 系统操作过程中,背景测定只需1次
5. 线粒体样品检测前,须溶解;建议冻存融解(-70℃至37℃)循环3次
6. 如果增强酶活检测,建议使用YIJI线粒体复合物待测样品预处理试剂盒-GMS10342
7. 加入样品启动反应后3秒内即刻比色测定
8. 96孔板测定初始读数(0分钟读数)0.5左右为理想状态;比色皿测定为1.0左右
9. 反应1分钟后比色测定值趋于稳定;测定值由高到低变化;测定可以持续5分钟
10. 测定值由高到低变化,即5分钟测定读数低于0分钟测定读数,表明有酶活性
11. 比色测定后,比色皿须清洗彻底
12. 建议待测样本线粒体蛋白浓度为10微克/100微升;如果样本酶活性过低或过高,则可以增加或降低样本量;注意计算公式的调整(本公司提供YIJI线粒体溶解试剂盒GMS10018为后续的线粒体蛋白浓度测定的预处理试剂盒和YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1)
13. 如果使用细胞或组织裂解悬液,则蛋白浓度为50微克/100微升
14. 线粒体呼吸链复合物II(琥珀酸-辅酶Q还原酶)单位活性定义为:在30℃,pH 7.5条件下,每分钟内能够还原1微摩尔合成辅酶Q同功类似物二氯酚靛酚(DCPIP)所需的酶量作为一个活性单位
15. 本公司提供系列线粒体及其酶类技术产品
质量标准
1. 本产品经鉴定性能稳定
2. 本产品经鉴定检测准确
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