Ä文献｜探究血浆中纯化外泌体的最佳组合

EVs广泛存在于人体的血液、乳汁、尿液以及唾液等多种体液中，其种类和数量与机体的生理状态息息相关。因此，EVs有望成为新型的疾病诊断标志物、纳米药物载体、治疗制剂和药物作用靶标，在疾病的诊断和治疗领域具有非常广阔的应用前景。

所有细胞都会将细胞外囊泡 (EV) 释放到血浆等生物液中。由于EVs的含量远低于血浆中的游离蛋白和脂蛋白，从丰度较高的游离蛋白和类似大小的脂蛋白中分离 EVs在技术上仍然具有挑战性。

近期，哈佛大学的一项研究使用了不同孔径的树脂的凝胶过滤层析法，分析比较了它们从血浆中分离得到EVs的得率，并评估去除游离蛋白和脂蛋白的效率，并开发了基于在同一层析柱中组合多种类型的层析填料的改进的EVs的分离方法。

装填好层析柱后，使用PBS清洗层析柱2次，每次加入5mL PBS洗液。随后取用1 mL血浆的血浆样品，在PBS洗液完全流出层析柱后进行上样。样品完全进入层析柱后，收集流出的0.5 mL的组分1。然后加入PBS，体积等于收集的一个组分体积 (0.5 mL) ，然后循环进行流出组分的收集，以及加入PBS的操作。对收集的组分记号留存备用。

对于EVs组分的评估实验，可在第6个组分（SEC方案）或第9个组分（DMC或TMC方案）收集结束后，一次加入四个组分体积的PBS (2 mL) ；然后在SEC层析方案取第7-10个组分，在DMC和TMC层析方案收集至9-12个组分。

研究者比较了使用SEC、DMC和TMC层析柱从血浆中纯化EVs的效果。研究者首先使用电子显微镜对每种层析柱的EVs进行成像，发现尽管脂蛋白仍然存在，但DMC和TMC的层析方式得到的EVs纯度高于脂蛋白（图2B）。

随后使用Simoa实验，将SEC、DMC和TMC柱对EVs、脂蛋白和游离蛋白的相对水平进行定量。标志物检测结果表明，与SEC层析柱相比，DMC和TMC层析柱明显地降低了ApoB-100和白蛋白的含量，但也导致了EVs产量的一些损失，特别是CD9。

Simoa使用SEC（组分7-10）、DMC（组分9-12）或TMC（组分9-12）的样本测量从1 ml血浆分离的细胞外囊泡 (EVs) 样品中的CD9、CD63、CD81、ApoB-100和白蛋白水平。 

 结果也表明，DMC和TMC柱的EVs产量低于SEC，但TMC柱的EVs/白蛋白的比率以EVs/ApoB-100比率显着较高，DMC柱EVs/白蛋白的比率与SEC基本持平，EVs/ApoB-100比率显著较高（图2C-E）。

最后，为了评估用TMC分离的高纯度EVs的效用，作者进行了基于质谱的蛋白质组分析。对血浆中的EVs进行质谱分析通常是具有挑战性的，因为游离蛋白和脂蛋白的水平比EV蛋白的水平高几个数量级。使用TMC，能够从仅1 mL血浆中分离出的EVs中检测到780种蛋白质，丰度远高于常规的三步法（PEG沉淀+碘己醇梯度分离+SEC）。这些结果证明了使用TMC进行小样本量深度蛋白质组学分析的优势。

作者最后总结，无论是最大化EVs产量的单模式SEC，还是最大化EVs纯度的三模式TMC，层析方式都是从临床样本中分离EVs的有力平台，具有价格便宜，工艺更稳定且运行时间短等特点。传统的密度梯度离心法通量较低且耗时，因此不适合于临床样品的EVs分离。

分离EV的最佳方法并不存在，因为选择的分离方法必须与其后续的应用相匹配。该研究后续需要极高纯度EVs，因而开发了TMC层析柱。作者预计TMC层析柱对于利用蛋白质组学发现EVs生物标志物将发挥巨大作用，因为EVs被其中脂蛋白和游离蛋白污染会阻碍深度覆盖，而TMC层析方式显著的降低了这些杂蛋白的混入。未来可利用并行运行层析柱的自动化设备，实现基于层析柱的方法处理临床样品的途径，该设备未来的迭代将进一步提高样本吞吐量。本研究开发的方法将有助于实现分子诊断中的EVs纯化分析。