流式实验中的坑，我都帮你踩过了——第一坑

流式实验中的坑，我都帮你踩过了——第一坑

案例介绍

客户样本细胞采用病毒转染，其中病毒有GFP荧光，检测时发现阳性比例62.61%，而荧光显微镜下则是满视野的带绿光细胞，而且荧光非常强，但流式图中显示的GFP+细胞比例似乎不够，同时荧光并非特别强，下图为客户端的原始分析图片，于是前往“流式错题集”医院看病。

小贝问诊答疑

01

该样本的检测结果图，直观上我们就可以找出来一个问题，那就是阈值设置不够完美，有太多碎片和死细胞，所以检测时可以手动改变下阈值，如下图，让散点图结果更干净。

02

散点图中SSC的电压设置不够合理，客户将SSC电压设置太高，导致细胞颗粒跑出了上方显示范围，如下图，所以应该降低SSC电压，让细胞群处在图上显示范围。

03

散点图中P1门位置值得商榷，为什么P1门不将如下散点图中深红色圈内细胞圈起来分析？经过询问，客户从以往经验来说，觉得SSC比较大的细胞不能圈，故而P1门只圈了一小部分SSC较小的细胞。

客户说的是有道理的，通常SSC较大的颗粒很大可能性是黏连的细胞，但经验归经验，我们实地做一个单细胞常规检查看看，如下图散射光图中将P1门增大后，多圈出来的细胞在FSC-A和FSC-H的黏连体识别图上，其实仍然处于单个细胞所在的区域，见下图蓝色箭头。

所以对该标本，我们应该优化P1门以及P2门的位置，优化完后我们下一步看看最后一张图，也就是GFP荧光检测的FITC与SSC的散点图，如下图，可见右上角一群带非常强的GFP荧光信号细胞群出现了，如下图蓝色箭头，所以到此，大家看明白了吗？

小贝处方

通过以上分析，该案例已经足够清晰，P1门的画法不当，导致了部分SSC较大的细胞未被选择用于分析，而这部分细胞即是GFP强阳的转染成功细胞，所以导致P3门圈中的GFP阳性信号百分比结果与荧光显微镜结果不一致。该样本如果重新规范画门，则是下图。

但这幅图还是不够完美的，除了刚才讲的阈值以及SSC通道电压设置不够合理，另外就是FITC通道GFP阳性已经超出右边坐标轴最大刻度值，所以在上机获取数据时应该降低FITC通道电压，如果荧光太强，降低电压还是无法完成该工作，则建议从厂家购买该通道的ND减光滤片，从而完美解决该问题。