如何使用荧光显微镜观察细胞

北京德泉

2021/07/12 14:11

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图1：图中显示了间接免疫荧光的典型工作流程，上皮细胞粘附在盖玻片上生长。培养后细胞被固定，因此用化学交联剂（如甲醛）将其杀死。再用清洁剂进行透化处理，使抗体穿过细胞膜。用正常血清、奶粉或牛血清白蛋白来进行封闭，可减少抗体与非靶向结构的非特异性结合，从而减少假阳性信号。接下来与一抗进行孵育，特异性识别靶向分子上的表位。在第二个培育步骤中，应用荧光耦合二抗，与一抗结合来实现靶向结构的可视化观察。抗体孵育后，用dapi或hoechst等嵌入dna的染料进行细胞核染色。在显微镜载玻片上涂有封固介质（例如mowiol或prolong gold）的盖玻片后，if即已准备好进行显微镜观察。

图2：有两种方法通过免疫荧光显示靶向结构：在两种变体中，一种特异的一抗用于识别靶分子上的特定表位。在此图中，目标分子由几个相同的蛋白质亚单位（=大分子）组成，因此会在每个亚单位上表现出几个相同类型的表位。为方便简化，此处只描绘了一个表位。

表1：此处的多色间接if示例演示了如何在同一个细胞中同时标记三种不同的蛋白质。三种蛋白质的一抗必须来自不同的物种，以便用三种不同的荧光色素耦合二抗来进行检测。二抗的荧光色素必须在波长光谱上有所区分才能在显微镜下进行不同的分析。

图一常见荧光蛋白和荧光素的发射光谱

图二在近红外一区，利用新型荧光标记可以获得更多信号。cos-7细胞图像，使用sir-actin（657 – 740nm探测范围）、af750-tom20（760 – 790nm）、af790-tubulin（810 – 850nm）标记。样本由苏黎世大学的jana döhner和urs ziegler提供。左：使用传统的gaasp探测器。右：使用stellaris 8。

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