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【应用笔记】-使用切口平移DNA标记系统2.0评估湿度对FISH反应的影响

北京德泉

2019/03/28 16:40

阅读：43

引言

普遍认为荧光染料dUTPs标记DNA优于间接两步标记法。结合切口平移DNA标记系统2.0，荧光dUTPs的使用为FISH应用荧光标签提供了一种简单而有效的方法。

切口平移DNA标记系统2.0适用于多种荧光标记、生物素标记和地高辛标记核苷酸，是包括荧光原位杂交(FISH)在内的应用中标记大于1kb的双链DNA的推荐方法。FISH是一种记录良好的技术，可以用来标记染色体中的DNA序列，用于科学研究和临床应用。

适当的荧光原位杂交需要相对湿润的环境条件;然而，目前FISH反应的最佳湿度还未可知。本研究的主要目的是利用Boekel Scientific RapidFISH Slide原位杂交箱演示切口平移DNA标记系统2.0在不同湿度条件下对FISH反应的影响。

“

实验材料/器材

1.切口平移DNA标记系统2.0 (Enzo Life Sciences, ENZ-GEN111)

2.绿色496 dUTP (Enzo Life Sciences，ez -42831)

3.原癌基因的Bacmid DNA

4.Nanodrop ND-1000 (Thermo Fisher)

5.QIAquick®PCR纯化试剂盒(Qiagen, 28104, 28106)

6.Cot-1 DNA (Thermo Fisher, 15279011)

7.VECTASHIELD®防褪色封固剂含DAPI(Vector Laboratories，H-1200)

8.RapidFISH Slide原位杂交箱(Boekel Scientific, 240200)

9.CGH Metaphase Target Slides(Abbot Molecular, 06J96-001)

10.荧光显微镜(Olympus, BX51)

11.温湿度数据记录仪(Madgetech, RHTemp101A)

”

通过切口平移进行荧光标记DNA按如下表1、2所示步骤用绿色496 dUTP标记。尽量降低移液误差的影响,熟练混合3ug bacmid DNA,试剂在切口平移DNA标记系统2.0试剂盒中,和5.2μL绿色496荧光标记dUTP(浓度为0.3mM)。

微信截图_20190328150452.png

纯化

标记为bacmid DNA的荧光染料必须在杂交前进行纯化。DNA探针采用QIAquick®PCR纯化试剂盒进行纯化。样本加入275μL PB Buffer轻轻混合(试剂盒),放置管中，室温16100 x g离心1分钟。弃掉上清，加入750μLPE Buffer(试剂盒)复溶后再次离心。加入10μL EB Buffer(试剂盒)将DNA洗脱,持续混匀一分钟,随后再16100 x g离心一分钟。

测定DNA荧光染料摄入率

用Thermo Fisher Nanodrop®ND-1000 UV-VIS分光光度计在微阵列测量模式下测定每个制备批次中绿色496 dUTP的摄入率。

杂交和观测

用雅培(产品，货号 06J96-001)将人类男性分裂中期切片加热到室温,准备杂交。每个样本均添加纯化后的绿色496标记的探针和3μg(1μg /μL) Cot-1 DNA。每个原位杂交箱的托盘中添加不同量的无核酸酶水。将所有样品分别放入Boekel RapidFISH Slide杂交箱中，37℃孵育过夜。

杂交箱内无核酸酶水分别在0 mL、5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL、30 mL进行检测。采用温湿度数据记录仪(Madgetech)对30秒采样率下的工作温度和相对湿度进行测量。孵化后,每个样品都仔细清洗和染色使用8μL VECTASHIELD®h - 1200防褪色封固剂含DAPI(1.5μg /毫升)处理，保证样本不变色。

杂交后的样品在杂交冲洗后用奥林巴斯BX51荧光显微镜和60X物镜立即扫描。所有图像均采用1秒曝光，同时使用DAPI和FITC荧光滤光片，以最好地评估湿度对FISH杂交的影响，同时尽量减少光褪色。

小结

利用切口平移DNA标记系统2.0将绿色496荧光dUTP充分整合到bacmid DNA中。使用Boekel Scientific RapidFISH Slide杂交箱进行FISH杂交，只需添加5 mL水分即可获得明亮的实验结果。当水分含量超过20mL时，反应效果不再变化。

图片1.png

Figure 1. 绿色496 dUTP探针(44.245 ng /μL)标记人类染色体8在37°C 25毫升nuclease-free水条件下进行FISH杂交后的成像效果。可视化前使用蓝色DAPI复染剂复染。
注意绿色荧光的清晰度和强度。

荧光原位杂交(FISH)条件: 25 mL of 水分, 44.25 ng/μL of 探针

Figure 2. 在杂交过程中，使用Madgetech RHTemp101A数据记录仪以30秒的采样速率连续采集温度和相对湿度条件。Boekel RapidFISH杂交箱具有升温快、杂交过程温度稳定的特点。

杂交孵育的湿度条件

Figure 3. 培养过程中收集0- 30ml的相对湿度，采样速率为30 s。每次增加水分(5 mL-30 mL)，平行两组实验所得的数据。相对湿度较低的红线，没有增加水分，表明杂交条件较差。

结论

我们进行两组对不同湿度下的使用绿色496荧光标记bacmid DNA探针的FISH杂交实验，以确定最佳条件，为FISH实验提供样例。Boekel RapidFISH原位杂交箱与切口平移DNA标记系统2.0一起被证明是快速、可预测和结果可重复的值得信赖的平台。Boekel RapidFISH载玻片杂交箱凭借特有的自锁托盘机构，在所有实验过程中，只要在载玻片杂交托盘中添加水分，该原位杂交箱始终保持恒温和湿度条件。只有当杂交托盘中不添加水分时，反映环境的相对湿度较低，且在孵育过程中波动较大。当使用Boekel RapidFISH Slide原位杂交箱时，我们建议添加不少于20毫升的无核酸酶水，以确保信号明亮。

附录 A: 其他FISH结果图

微信截图_20190328151742.png