【应用笔记】-Amersham typhoon--Western Blotting智慧之选

北京德泉

2019/03/15 10:51

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Western blotting是研究蛋白表达最常用的经典技术，常用于检测靶蛋白的丰度、检测蛋白的修饰、蛋白相互作用研究中。常用化学荧光、化学发光和荧光三种方式对结果进行成像和定量分析。

1）化学荧光：

化学荧光采用ECL Plus底物代替化学发光检测底物ECL检测Western blotting信号，具有灵敏度高、线性范围宽的特点。ECL Plus试剂与HRP标记的二抗反应，反应产物在488nm激光激发下能够产生发射光，发射光通过Cy2滤光片由检测器接受，并转化为电信号。化学荧光可由激光共聚焦成像仪Amersham Typhoon检测，超大检测面积，可同时检测20张10×8cm印迹膜，

2）近红外双通道荧光

用近红外荧光标记的二抗取代HRP标记的二抗进行Western blotting检测，在抗体孵育结束后，即可直接利用激光共聚焦成像仪Amersham Typhoon进行成像，不需要添加ECL底物，不需要在暗室进行X光片曝光，减少了实验步骤，节省时间，也节约了实验成本。

印迹膜在近红外波段具有较低的自发荧光，使得在成像时容易获得极低的背景，保证检测的高灵敏度。同时，近红外荧光具有宽的线性范围，使得定量更准确。通过双近红外荧光标记的二抗，不需要stripping和reprobing即可在同一张膜上同时检测目的蛋白和内参蛋白，实现同一泳道内参蛋白归一化，使定量更准确。同时，双通道检测更便于研究蛋白磷酸化水平。

3）三通道荧光

使用双色荧光标记二抗和一个荧光直接标记的一抗，可以在一张膜上同时检测三个蛋白，如内参蛋白、目的蛋白和磷酸化蛋白。在磷酸化水平的检测中，引入内参蛋白归一化校正不同泳道间的上样量差异，使得实验设计更严谨，所得结果更准确。

4）总蛋白归一化，定量更准确

利用上样的总蛋白含量进行泳道间归一化，避免了内参蛋白选择烦恼。总蛋白归一化可基于荧光染料的蛋白质预标记技术，即在上样前，通过Cy5染料将蛋白标记上红色荧光。电泳结束后直接获得SDS-PAGE电泳图像，无需染色；也可在转印结束后根据膜上Cy5信号强度，判断转印情况；总蛋白信号代替内参蛋白用于归一化处理，结果更准确。

总蛋白归一化与内参蛋白归一化相比具有：更宽的检测范围，更强的蛋白信号，含量不受处理条件影响的特点。