【CNS前沿文献追踪】 – 调节T细胞疲劳的转录因子NR4A

实体瘤CART疗效不佳的一大原因是肿瘤免疫抑制的微环境造成T细胞疲劳，此次整理分享的文章是关于T细胞疲劳调节的，文章作者筛出来一个调节T细胞疲劳的转录因子NR4A，具体内容如下：

作者要研究实体瘤CART，得造实体瘤的模，偷了个懒，让肿瘤细胞表达CD19，这样就能用CD19 CART做实验了：各种肿瘤细胞系可稳定表达CD19，且表达CD19不影响肿瘤细胞在小鼠上从成瘤

设计针对CD19的CART并验证CART功能

在两个模型上（荷瘤小鼠移植CART和OT-1抗原特异性T细胞）研究浸润到肿瘤部位的T细胞：浸润到肿瘤部位的CD8+T细胞由CART、OT-1特异T细胞、内源性T细胞组成，这三种细胞的疲劳marker表达情况相似 - 大部分处于“疲劳”状态

将肿瘤浸润T细胞（TIL）分离出来研究其功能，发现浸润的T细胞响应刺激分泌细胞因子的能力很弱 - 功能角度也说明TIL处于“疲劳”状态

按疲劳marker表达情况将TIL分离出来进行RNA测序：基因表达情况受疲劳marker表达影响，疲劳marker表达水平相当的内源T和CART基因表达相似，受相同“变量”影响

RNA测序反应基因的表达情况，基因表达受染色质开放性影响，所以对不同的TIL又进行了染色质开放性测序（ATAC-seq），发现PD-1高表达的TIL染色体开放性类似，NR4A（NUR77）、NFAT、NFκB、bZIP、IRF：bZIP位点开放性高

ATAC-seq发现一些位点开放，那这些位点对应的蛋白表达量如何呢，作者发现PD-1高表达的细胞NR4A表达量也高（与ATAC-seq数据一致，至于测没测NFAT、NFκB、bZIP、IRF：bZIP这些开放性也升高的位点对应蛋白作者没提，估计是测了，但得到的数据不那么好讲“故事”）

由染色质开放性挖到转录因子NR4A蛋白水平高表达，且与PD-1蛋白水平相关，那两者在基因表达水平上的关联呢？RNA-seq结果表明NR4A的表达水平和TIM3（HAVCR2）、PD-1（PDCD1）的表达水平正相关 - 至此的数据暗示转录因子NR4A参与调节T细胞的疲劳

转录因子NR4A参与调节T细胞的疲劳这个初步的结论是在小鼠模型数据基础上得到的，在人的模型上又进行了ATAC-seq，发现PD-1高表达的细胞NR4A（NUR77）位点的开放性也很高 - NR4A更具研究价值，参与T细胞疲劳调节

分子层面的的数据说明NR4A和T细胞疲劳存在相关性，开始从功能角度验证：敲掉NR4A的T细胞一会肿瘤生长、延长小鼠存活时间的作用增强，说明NR4A对于肿瘤免疫起负调节作用

换了个T细胞移植时间，继续看敲掉NR4A的影响：疲劳marker表达降低、响应刺激分泌细胞因子的能力增强，再次说明NR4A对肿瘤免疫有负调节作用

敲掉NR4A发现促进肿瘤免疫，作者又让细胞额外表达各个NR4A亚型看对免疫细胞的影响，发现额外表达NR4A后T细胞表面抑制性分子表达升高、响应刺激分泌细胞因子的能力减弱

对分别额外表达各个NR4A亚型的细胞进行RNA-seq和ATAC-seq，发现各个NR4A亚型对基因表达的调控作用相似

前面从功能角度可能敲掉NR4A对肿瘤免疫的影响，NR4A是个转录因子，测序是必须的，敲掉NR4A后进行RNA测序，发现敲掉NR4A的细胞效应蛋白（IL-2Rα, TNF and granzymes）相关基因表达上调、naive或memory T相关基因（Sell, Ccr7）表达下调、抑制性分子（(Pdcd1, Havcr2, Cd244, Tigit and Cd38）相关基因表达下调

RNA测序发现敲掉NR4A后细胞上调的基因有500多个，为了找到NR4A直接调控的基因，作者又在细胞上过表达了NR4A，发现过表达后，上调的基因有Pdcd1, Havcr2, Cd244, Tox, Tigit, Cd38（抑制分子基因），下调的基因有Tnf and Il21（效应分子基因）

染色质开放性测序发现：敲掉NR4A的细胞bZIP、Rel/NFκB开放性增强，利于T细胞效应相关基因表达

ATAC-seq发现NR4A敲除细胞bZIP、Rel/NFκB开放性增强，ChIP-qPCR也确证了这点，与前面RNA测序结果一致 - IL21、TNF染色质开放性增强、表达增加（从转录层面说清了敲除NR4A后T细胞响应刺激分泌细胞因子能力增强）

再从转录层面说清NR4A对PD-1表达的调控：PD-1高表达的疲劳T细胞Pdcd1（PD-1基因上NR4A结合位点开放性高，初始T、效应T、记忆T的Pdcd1上NR4A结合位点开放性则低，强制表达NR4A各亚型后Pdcd1上NR4A结合位点开放性由低转高

造模、测序筛了半天，缕出的关系大概这样：NR4A促进T细胞抑制性分子表达、抑制T细胞发挥免疫功能

测序这种大数据技术辅助文章作者筛出了NR4A，是技术、工具本身牛？还是使用技术、工具的人牛？人可以将测序大数据归类、降维，可以利用“已知”指导数据的进一步挖掘，可以选择其他技术路线对由数据产生的推论进行验证，等等......

Joyce Chen, Isaac F. López-Moyado, Hyungseok Seo, Chan-Wang J. Lio, et al. NR4A transcription factors limit CAR T cell function in solid tumours [J].Nature, 2019.

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