【CNS前沿文献追踪】长非编码RNA SLERT“解绑”被DDX21“捆住”的RNA聚合酶Pol I

       长非编码RNA主要起维持细胞核完整、调控基因表达的作用，此次整理分享的文章研究的是长非编码RNA在核糖体RNA合成过程中如何发挥其调控作用。这篇文章做的极其“细腻”，具体内容如下：

RNA测序发现长非编码RNA SLERT高表达，NB也确认了这一点

SLERT表达模式

以SLERT表达水平相对低的HeLa细胞为工具，设计缺失不同位点的质粒转染，NB检测SLERT表达水平，发现位于末端的H/ACA snoRNP对于SLERT表达是必须的

SLERT定位于核仁，而编码SLERT的TBRG4 DNA不定位于核仁，暗示SLERT表达后会重定位
 

对SLERT进行突变，发现位于末端的snoRNA被突变后SLERT不再定位核仁，而具备snoRNA末端、中间序列插入EGFP组依然定位于核仁，暗示SLERT需要snoRNA末端以重定位到核仁

因为SLERT定位于核仁，而核仁是rRNA的合成场所，所以设计用CRISPR Cas9 KO掉SLERT：只KO了SLERT，而未影响TBRG4蛋白的表达

KO SLERT后pre-rRNA及成熟rRNA均下调，暗示SLERT参与rRNA的合成调控

F：5-FU阻断pro-rRNA processing发现KO SLERT后未成熟pre-rRNA合成降低，暗示SLERT是在转录层面调节rRNA的合成；G：荧光素酶报告基因法确证了SLERT是在转录层面进行调节

KO之后rescue再次确证SLERT调控pre-rRNA合成

在功能上的调控必定依赖于结构层面的互作，因此给SLERT加一个tRSA标签，去“钓”与SLETRT互作的蛋白（RBPs）

钓完之后质谱分析，发现了蛋白DDX21

反过来蛋白DDX21也钓到了SLERT，共定位结果也确证了两者发生互作

完整的SLERT和非snoRNA段钓DDX21的能力相当，暗示SLRERT上互作位点在非snoRNA段

看SLERT上哪一段与DDX21互作-281-423的143nt长片段

EMSA实验再次确证SLERT143为与DDX21互作序列

由SLERT以互作为线索找到了DDX21，看DDX21的定位情况：定位于核仁

SIM拍到了DDX21在核仁内更加细节的情况：DDX21呈圆环样分布于核仁，平均每个细胞有约60个圆环状结构（为了排除是抗体或者固定造成的环状结构，作者还做了活细胞成像，确证DDX21呈环状分布）

分别用AMD阻断rRNA转录或5-FU阻断rRNA processing发现阻断转录后DDX21不再形成环状结构，阻断rRNA processing不影响其环状结构形成，说明DDX21的组装发生在rRNA转录阶段
 

DDX21组装成环状结构在转录阶段形成让人联想到在转录阶段很重要的RNA聚合酶，SIM观察两种共定位后发现RNA聚合酶亚单位RPA194定位于DDX21环的中心位置

多种细胞系的活细胞成像结果确证了RNA聚合酶定位于DDX21环状结构中心

IP结果确证了DDX21与RNA聚合酶发生互作

结构层面的互作往往意味着功能层面存关联，沉默DDX21后发现pre-rRNA及未成熟pre-rRNA上调，暗示DDX21抑制rRNA的合成

沉默DDX21后，编码rRNA的rDNA占位增加，暗示DDX21是通过阻止RNA聚合酶占位DNA抑制rRNA的转录最终抑制rRNA的合成

前面观察到DDX21环状结构中心是RNA聚合酶，而RNA聚合酶可以结合rDNA，这些再结合支撑文档一些数据（略）提示做三者的共定位研究，发现：RNA聚合酶包裹rDNA，DDX21包裹RNA聚合酶这种“大圈套小圈”的模式

前面已经证实DDX21能影响pre-rRNA的合成，那两者的定位关系呢：pre-rRNA定位与DDX21环状结构边缘，pre-rRNA的量与DDX21环的直径正相关

前面还发现了SLERT能影响pre-rRNA的合成，共定位研究发现SLERT与DDX21共定位，不与RNA聚合酶共定位

SLERT不但与DDX21共定位，而且其表达量与DDX21环的直径正相关

KO SLERT并不影响RNA聚合酶及DDX21的表达，但这三者都能影响pre-rRNA的合成，且存在一定关联(互作/共定位)，SLERT影响DDX21环的直径，文章作者创造性的假设SLERT通过影响DDX21构象调节pre-rRNA的合成

荧光共振能量转移实验研究SLERT对于DDX21分子内及分子间互作的影响，发现KO SLERT之后DDX21分子内头尾互作降低，分子呈open构象；分子间互作不收SLERT调节

IP找DDX21上与SLERT及RNA聚合酶互作的序列（两端序列负责定位，支撑文档里有相应数据支持，略去）

KO SLERT后DDX21与RNA聚合酶互作增强，暗示Open构象的DDX21（这个说法依据为FRET结果）与RNA聚合酶互作能力强

IP实验确证：SLERT竞争性抑制DDX21与RNA聚合酶互作

过表达SLERT促进RNA聚合酶对rDNA的占位，KO则抑制，结合前面的结果：SLERT通过竞争性抑制DDX21与RNA聚合酶的互作促进RNA聚合酶占位rDNA，启动转录

综合起来：SLERT与DDX21互作，促进其分子内头尾互作，影响DDX21构象使其组装成更大的减少与RNA聚合酶Pol I的互作，促进pre-rRNA的合成。当SLERT缺乏时，DDX21成open构象，组装成的环直径变小，与RNA聚合酶Pol I互作，抑制pre-rRNA的合成

失调的rRNA合成与肿瘤发生有关，KO SLERT后细胞增殖及肿瘤生长受到抑制，过表达则促进细胞增殖，，暗示SLERT能促进肿瘤发生 - 做两个小实验“拉近”一下和应用转化的关系-a potential therapeutic target

 
文章按逻辑顺序呈现：发现SLERT通过与DDX21互作改变DDX21构象进而改变其组装成的环状结构直径，降低与RNA聚合酶的互作，最终促进pre-rRNA的合成，然而实验进行的历史顺序很可能不是这样的！实验数据往往是纷乱的呈现在我们眼前，怎样才能抽丝剥茧缕清线索？笔者浅薄的认知：主线是基于结构的互作传递、产生量变引起生命活动的变化！对于这篇文章：SLERT、DDX21的量分别与pre-rRNA正、负相关，这种量的相关性来源于互作 - SLERT“包裹”DDX21，DDX21“包裹”RNA聚合酶，RNA聚合酶“包裹”rDNA。
 
Xing Y H, Yao R W, Zhang Y, et al. SLERT, Regulates DDX21 Rings Associated with Pol I Transcription[J]. Cell, 2017, 169(4):664.
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