【应用笔记】-利用无标记细胞计数进行细胞增殖动力学分析

       在评估药物治疗中的细胞应答过程时，细胞增殖动力学分析经常用于对细胞种类及生长速度进行观察。传统的细胞计数常使用生化试剂检测（如MTT、CCK-8）或对细胞进行荧光标记。然而，多数荧光染料对活细胞具有毒性，明显影响细胞的长期培养，如使用DAPI/Hoechst标记细胞核。此外，也可构建表达荧光标记的稳定细胞系，但是这需要投入很大的精力和财力。

       相对地，无标记细胞计数具有明显的优势，无需进行耗时耗力的细胞染色，更不用担心荧光染料对细胞活力的影响。
 
       使用Cytation5的高对比度明场成像模块，基于聚焦、离焦图像和Gen5 分析软件，即可快速完成对每个细胞的识别并进行密度计算（图1、图2）。

图1. 高对比度明场细胞直接计数

（a）Nih3t3细胞的聚焦图像（b）离焦图像可根据每个细胞产生独立的亮点（c）Gen5软件Masking工具可根据每个亮点进行细胞计数

图2. 多个时间点的细胞密度计算结果

       将Cytation5基于高对比度的明场无标记细胞计数结果和使用Hoechst标记获得的结果进行对比，来自两种技术的NIH3T3细胞计数结果在不同的细胞密度下高度可比，将点拟合到非线性回归方程中，R²值为0.99，斜率为0.97，两者几乎没有差异（图3）。

图3. cytation5明场成像和hoechst荧光成像的结果对比

       如图4所示，两种方法表现出了两种不同的细胞生长特征。与细胞汇合度数据相比，基于无标记细胞计数的数据更准确，测得的生长曲线对数期更宽（至100%汇合）。

图4. 不同时间点高对比明场细胞计数相对于细胞汇合数据的比较

 
       在高通量药物筛选领域，Cytation 5可以轻易地监测不同药物作用下的细胞生长曲线（图5），以及计算药物的半抑制浓度IC50（图6）。

图5. 在两种药物8种不同浓度的作用下，Hela细胞在96孔微孔板基质上5天时间内的细胞生长曲线图

图6. 计算药物对不同细胞的半抑制浓度ic50

      Biotek智能成像设备Cytation 5非常适合于高通量检测和显微成像，在无标记细胞计数实验中的表现非凡。配合Biospa8自动化孵育器，可进行细胞动力学增殖监测。

       美国伯腾仪器有限公司（Biotek Instruments, Inc.,）是全球领先的设计、制造和生产商，其产品一直保持美国原产地设计和制造。自从1981年推出第一款酶标仪，Biotek 逐渐发展成为以微孔板为基础、旨在提高医疗、制药、农业和研究等领域客户生产效率的全球领先者之一。biotek产品线覆盖酶标仪、液体处理系统、成像系统、自动化系统，为客户提供全方位的技术服务。