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好！热！啊！小G是一个特别怕热的人，除了西瓜、汽水、冰淇淋外，令我感到清凉的也就只剩下学习新的知识了！今天小G给大家带来一些关于亲和纯化的知识，抱起你手中的西瓜，我们开讲咯～

做为最常用的亲和纯化标签，6xHis可以说是无人不知，无人不晓～不过到底你对它了解多少呢？今天小G就给您详细介绍一下6xHis的前生今世。

6xHis标签，也称为多组氨酸标签，His6标签或六组氨酸标签，是在转染细胞中由与靶蛋白的羧基（C-）或氨基（N-）末端融合的至少6个组氨酸残基组成的氨基酸序列。该标签最常应用于生产重组蛋白，因为组氨酸残基可以在特定的缓冲条件下与几种类型的固定化离子（如镍，钴和铜）结合，可方便简单地检测和纯化His标签蛋白质。

Fig.1 His-tag-primers

由于其相对较小的尺寸、很低的免疫原性、亲水性和在洗涤剂及在有许多其它添加剂存在的情况下保有的多功能性，多组氨酸标签现在被认为是用于多种蛋白质纯化的最广泛使用的亲和标签。

此外，整个纯化过程均可在天然或变性条件下完成。其不使用蛋白质特异性抗体或探针就可以完成检测和纯化重组蛋白质的能力都使6xHis标签更受欢迎。

蛋白质亲和纯化

在大肠杆菌和其他原核系统中表达的罕有聚组氨酸标签的重组蛋白通常使用固定化金属离子亲和层析或IMAC纯化。在该方法下，用适当的螯合剂如次氮基三乙酸（NTA）或亚氨基二乙酸（IDA）将载体（通常为琼脂糖或磁珠）衍生化。

这些螯合基团会固定所需的二价金属离子（例如镍，铜，钴和/或锌），达到将目标生物分子与蛋白质混合物结合和分离的目的。在选择合适的配体时，您需要考虑IMAC树脂的结合能力严重依赖于目标蛋白质和纯化过程中使用的金属离子本身特性的这一事实。

镍，钴和铜通常用于纯化His标记的蛋白质，主要是由于其在水溶液中对组氨酸和半胱氨酸的亲和力。其中，镍是迄今为止最广泛使用的金属离子，对His标签蛋白具有最高的亲和性和选择性。然而，它也可以结合非特异性结合的含有组氨酸簇的内源性蛋白质杂质。

钴提供与组氨酸标签更特异的结合，因此当纯度是主要关注点时，它就是最佳的二价阳离子。

与镍和钴相比，铜离子与His-标签的结合力更强，但其在三者中具有最低的特异性。正式因为这个原因，仅当纯度不是主要目的时才会使用铜IMAC。

纯化过程方法

我们在制备样品时，一般会先收获细胞，再通过酶或使用物理机械方法进行裂解。由于Poly-His标签在生理pH和离子强度下与IMAC树脂结合地最好，所以推荐在接近中性缓冲条件下进行结合。大多数研究人员使用含有10至25mM咪唑的Tris缓冲盐水（TBS）作为结合/洗涤缓冲液，以防止内源蛋白与组氨酸簇的非特异性结合。最后，捕获的His-标签的蛋白质的洗脱和回收通常使用增加的咪唑浓度（至少200mM），低pH或过量的强螯合剂如EDTA来完成。

当然，您可以在各种起始缓冲液中纯化样品，因为高浓度的盐和某些变性剂都相容的。但需要注意的是，还原剂，氧化剂和螯合剂如EDTA通常与IMAC亲和化学不相容。

His标签蛋白的其他应用

除了多组氨酸标记的重组蛋白的纯化外，6xHis标签也可用于以下应用。

ELISA或Western blot检测

您无需使用抗体就可以使用镍螯合HRP酶来对His标记蛋白的HRP检测。或者，您也可以使用对组氨酸标签的蛋白具有高度灵敏和特异性的抗6xHis抗体来进行实验。

蛋白质相互作用pull down

镍琼脂糖树脂可用于纯化，鉴定和测量His标记蛋白质的相互作用物质。

微孔板涂层

镍或铜包被的微孔板可以将融合蛋白从粗制或半纯化样品包被以进行各种平板分析。

凝胶染色

有多种免疫分析方法可以利用多组氨酸标签通过抗多组氨酸标记抗体或通过SDS-PAGE检测靶蛋白。

荧光标签

现有开发的荧光6xHis标签，使研究人员能够更容易地调查蛋白质的迁移和转运。

再下一期的《G课堂》中，我们将为大家介绍一下常用的疏水层析。我们下期再见。Bye！

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