G课堂 |【Q&A】Western Blotting技术问题解答（上）

        Hello! 大家好，我是小G。好久不见！在这个春暖花开的季节，我们的知识储备也要更新咯！

  Western Blotting作为现代生物技术最普及的技术之一，得到了生命科学界广泛的认可。但对于实验操作者而言，因为其步骤较多，一个步骤的bug会导致整个实验立题和评估的逻辑混乱。

       今天，小G就搜集了一些大家可能在实验中遇到的一些问题，给大家详细地阐述一下原因，并提供一些解决建议，让大家再也不担心Western 的操作步骤！

 第一部分：转印步骤中的问题

 Q1: 小G，为什么我在转印后，在膜上检测的蛋白比较少，或是根本没有我的目的蛋白呢？

 A1: 其实，造成这种情况的原因可能是多种多样的，对应的解决方法如下：

原因一：凝胶与膜接触不好

解决方案：确保转印时滤纸、凝胶、膜摆放位置正确并接触紧密，无气泡。转印后，凝胶可以用丽春红染色或者预染marker检查转印效率。转印中使用较厚的3MM, 17CHR或GB系列转印滤纸。

     原因二：转印装置正负极摆放不对

解决方案：确保膜处在阳极位置，凝胶在阴极。确保转印正负电极连接位置正确。

     原因三：目的蛋白被其他高丰度蛋白掩盖，如白蛋白，IgG等。

解决方案：去除高丰度蛋白。

Q2: 我在膜上看到蛋白条带出现smear拖尾，这种情况应该怎么解决？

A2: 出现这样的现象有两种可能：

     原因一：转印过程过热

解决方案：

① 对于湿转：首先，确保转印槽中buffer没过转印模块；Buffer可先预冷或者在低温环境下进行转印；也可以降低转印电流电压，延长转印时间。

②对于半干转：降低转印电流，不要超过0.8 mA/cm2；增加转印滤纸数量。

     原因二：蛋白样品过量或者有杂质干扰，如脂类、核酸、IgG、白蛋白等。

解决方案：使用GE相应的样品分级及除杂试剂盒，去除杂质。

 Q3: 我的目标蛋白分子量比较小，转印的效率比较低，该如何提高转印效率呢？

 A3: 可以检查以下几点来解决：

      原因一：小蛋白在膜上结合量少。

解决方案：使用蛋白结合能力更强的膜；增大SDS-PAGE凝胶浓度；使用小孔径印迹膜，如0.1um或0.2um Protran印迹膜。

      原因二：转印buffer中残留的SDS 影响蛋白与膜的结合。

解决方案：转印buffer中不要有SDS，转印前凝胶与转印buffer平衡至少15min以上。

      原因三：转印buffer中甲醇浓度太低。

解决方案：提高甲醇的浓度（15%-20%）。

      原因四：蛋白结合时间不够。

解决方案：调低电压，延长转印时间。

 Q4: 我的目标蛋白分子量比较大，转印的效率比较低，该如何提高转印效率呢？

      A4: 可以检查以下几点来解决：

      原因一：甲醇浓度太高。

解决方案：降低甲醇浓度至10%（V/V）以下。。

     原因二：蛋白凝胶浓度太高。

解决方案：降低凝胶浓度；也可以在转印buffer中添加0.1%SDS，促进蛋白溶解。（注意：SDS可以促进蛋白的溶解，但是也会破坏蛋白与膜的结合）。

      原因三：蛋白结合时间不够。

解决方案：调低电压，延长转印时间。

      Q5: 我在进行半干转印时，发现转印的效率比较低，该如何提高转印效率呢？

      A5: 发生这种情况的主要原因是电流未经过“三明治” 印迹膜/滤纸组合，我们可以通过以下方法来解决：首先确保滤纸、凝胶和膜的尺寸大小一致；其次，PVDF膜预先用甲醇浸泡，转印三明治先用转印buffer充分浸湿，最后一点要确认三明治中间无气泡和空隙。

      好了，以上就是第一部分：转印步骤中的问题。在下一期，我们将给大家解答一些我们在标记和检测信号时遇到的一些问题以及解决方案。如有问题，您也可以联系我们GE产品线的所有技术支持。

      那我们下期再见，Bye Bye。

Amersham™ 品牌简介

      20世纪40年代，Amersham（安马西亚,GE医疗生命科学的前身）开创了放射性同位素示踪剂产品，促进分子生物学的重大进展，最终创造分子生物学史上的里程碑，如DNA测序。

      接下来的几十年间，Amersham继续为科学与医学做出重要贡献，如推出世界上第一款测量糖尿病患者的胰岛素水平的放射免疫分析试剂盒。Amersham创新传统为非放射性标记的发展做出重要贡献。1990年，Amersham ECL试剂成为第一个用于Western Blotting的化学发光底物，成为“化学发光”的代名词，至今文献引用排名第一。

      GE 医疗生命科学提供广泛的Amersham化学发光、化学荧光与荧光检测的成像产品组合，成为业界的高质量和高可靠性的不二选择。

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