G课堂 |【Tips】利用SDS-PAGE确定目标蛋白分子量大小

 Hello!大家好，我是小G。今天的主题是大名鼎鼎的Amersham™！小G也和今天的主题一样，变了个装，给大家带来一些关于电泳实验的小技巧。让我们速速进入正题吧~

做蛋白相关实验时，我们在前期会对已知蛋白，利用软件来计算他们的分子量大小。但是对于一个未知蛋白，我们应该怎样来预估它的大小呢？最常用的方法就是利用SDS-PAGE。

尽管还有许多其他的方法（i.e. 分析超离，光散射）来计算未知蛋白的分子量，但是都需要大量的高纯度的蛋白或贵重的仪器，所以并不常用。

那么，怎样利用SDS-PAGE来确定未知蛋白的分子量呢？

利用SDS-PAGE测定蛋白分子量：实验过程总览

若想确定一个未知蛋白的分子量，首先你要在一块SDS-PAGE胶上随一组Marker对你的样品进行分离。然后利用适当的染色方法进行染色，清洗后即可得到可见的、清晰的蛋白质条带。

在此，你可以利用Amersham Imager 600清晰地对你的凝胶进行成像，所得到的图像可直接用于接下来的分析（如图1）。当然，你也可以利用胶尺或普通的尺子进行手工测量。

图1：典型的SDS-PAGE凝胶电泳图

在得到胶的图片后，需要确定分子量标准（Standards）以及未知蛋白的相对迁移率（relativemigration distance, Rf），相对迁移率可以跟据如下公式进行计算

图1的测量数据见表1。如表所示的迁移距离在电脑测量，以像素为单位。你可以使用胶尺或者尺子进行测量（长度单位）。

表1：图1凝胶测量结果

根据表1中每个条带迁移距离，我们可以求出每个条带的迁移率。之后我们再以每个条带大小的对数为纵轴，迁移率为横轴作图，即可绘出如图二所示的线形图。如果样品完全变性且测量准确，我们可以得到一条较为吻合的趋势线，并求出其中的趋势线方程。

如果你得到了一条S形的曲线，则说明由于凝胶的筛型效应过强而限制了分子的穿透力或凝胶的筛型效应太弱导致了分子几乎可以在凝胶中自由迁移。

图2：表1结果线形图

最后，你可以在图中插入未知蛋白的测量值（迁移率Rf），即可得到未知蛋白的测量大小。

记住，这种方法测量出的蛋白大小的误差在±5%左右。由于一些多肽（如二醇类或脂蛋白）不能完全被SDS包被，所以会出现结果不够准确的情况。如果想得到最准确的结果，可通过质谱进行进一步地证明。

在本文的案例中，未知蛋白的迁移率为0.50584380，带入公式我们可以得到Log(未知蛋白MW)=1.6612，最后求出目标蛋白分子量为45.83。这个蛋白的软件预测大小为45.29。所以我们得到的结果还是比较准确的。

为你的分子量测量实验创造理想缓冲液环境：简单又必要的条件。

如果你想通过SDS-PAGE来测量你的目标蛋白质的分子量大小，你应该确以下几方面基本因素来创造合理的实验条件以降低外部因素对你结果的影响。这些因素虽然简单，但却非常必要。

1）目标蛋白与分子量标准必须在相同条件下的同一张凝胶上进行实验；

2）利用更多的数据来获得更准确的结果。尝试使用三次以上的重复实验来计算；

3）溶解蛋白时，应加入还原性试剂来彻底打开二硫键。二硫键会影响二级结构的迁移率；

4）样品缓冲液中必须含有SDS。SDS会与蛋白质二级结构，三级结构以及四级结构的疏水区域结合，给予蛋白质净负电荷。而且，SDS在变性过程中的表现也较为温和，可以在不改变初级结构的条件下改变蛋白质的生物性质。

最好需要注意的是，良好的线性范围是得到准确结果的必要条件，如果可以对样品进行定量，请加入与分子标准相同量的样品，以保证结果的准确性。

好了，相信现在你对利用SDS-PAGE对未知蛋白分子量的测量方法有了更深的了解，小G也希望这些实验技巧可以切实地帮助所有在实验室奋斗的同学。

此时，春节已经临近，小G在此先给大家拜一个早年，祝愿大家在新的一年里，实验顺利！健康平安！心想事成！万事如意！

我们新年再见啦！

Amersham™品牌简介

20世纪40年代，Amersham™（安马西亚,GE医疗生命科学的前身）开创了放射性同位素示踪剂产品，促进分子生物学的重大进展，最终创造分子生物学史上的里程碑，如DNA测序。

接下来的几十年间，Amersham™继续为科学与医学做出重要贡献，如推出世界上第一款测量糖尿病患者的胰岛素水平的放射免疫分析试剂盒。Amersham™创新传统为非放射性标记的发展做出重要贡献。1990年，Amersham™ECL试剂成为第一个用于Western Blotting的化学发光底物，成为“化学发光”的代名词，至今文献引用排名第一。

GE医疗生命科学提供广泛的Amersham™化学发光、化学荧光与荧光检测的成像产品组合，成为业界的高质量和高可靠性的不二选择。

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