上海生科院利用双生病毒载体系统实现 CRISPR/Cas9 对水稻内源基因的高效定向敲入

3 月 19 日，《分子植物》（Molecular Plant）杂志在线发表了中国科学院上海生命科学研究院植物逆境生物学研究中心朱健康研究组题为 Gene targeting by homology-directed repair in rice using a geminivirus-based CRISPR/Cas9 system 的研究论文。该工作将 CRISPR/Cas9 系统和双生病毒载体系统整合，在水稻中实现外源基因的定向敲入，其效率最高可达到 19%。该研究提供了一种在植物基因组中简单高效地实现同源重组或外源片段定点敲入的新方法。

CRISPR/Cas9 系统在基因编辑方面已经得到了大量的应用，该系统可利用修复途径中占非主导作用的同源介导修复（homology directed repair, HDR) 来实现基因同源重组 (homologous recombination，HR) 或定向插入（knock in），但该修复的效率很低，大大影响了 CRISPR/Cas9 的基因编辑效果。相对于动物细胞和人类细胞，由于有细胞壁的阻碍，在植物界进行 HDR 的一个巨大挑战就是如何把足够大量的供体分子输送到细胞中去。为突破这个瓶颈前人已经做了大量尝试，最近 Voytas 等人开发了利用双生病毒系统（Geminivirus）进行 HDR 的新途径。Geminivirus 是一类拥有众多成员的植物病毒，能侵染大多数单子叶和双子叶植物，它们的基因组由 2.5-3kb 的单链环状 DNA 组成，可被改造成 HDR 所需的供体分子。当 Geminivirus 侵染植物细胞后，病毒的大量复制特性使得细胞内产生大量的供体分子，数量可高达数百至数千拷贝，从而大幅提高 HDR 的机率。

朱健康研究组改造了 Geminivirus 中的一个成员——小麦矮缩病毒 (wheat dwarf virus, WDV)，在水稻愈伤组织中的测试发现其提供供体分子的数量是传统 T -DNA 的数百倍。该研究进一步把 CRISPR/Cas9 系统和 WDV 系统整合，辅以定向筛选的方式，对水稻内源的 ACT1 和 GST 位点定点插入 GFP 标记，对转化植株的鉴定表明外源基因定向敲入的效率最高可达到 19%。该研究提供了一种在植物基因组中简单高效地实现同源重组或外源片段定点敲入的方法，将在基因功能研究和作物精细育种中发挥重要作用。