Proton和HiSeq外显子组平台比较，单核苷酸变异检测均表现良好

由Julia Karow供稿
美国国家癌症研究所的研究人员在近日发表的有关Proton和HiSeq 平台的对比研究显示，在进行外显子组测序时，Life Technologies的Ion Proton和Illumina的HiSeq 2000在单核苷酸变异检测方面均表现良好，但在准确检测插入缺失时存在某些问题。
该研究于本月初刊载在《人类遗传学》上，很可能是首个发表的有关这两个平台性能对比的研究。该研究将采用Proton和HiSeq对HapMap CEPH三元家族生成的全外显子组测序数据检测到的变异进行了比较。此外，还对从Complete Genomics公司获得的全基因组测序数据的变异以及相同三元家族的Illumina SNP微阵列数据的变异进行了对比。
美国国家癌症研究所（NCI）癌症基因组学研究实验室的研发部主任和该研究的首席作者Joe Boland声称，本项目旨在评估其实验室能否将去年九月安装的Ion Proton常规用于外显子组测序，以作为HiSeq的可行替代方案。Joe Boland表示，“HiSeq是目前研究的黄金标准”。
“令人兴奋的是，答案是肯定的，Proton的表现与HiSeqs旗鼓相当”，Joe Boland告诉《In Sequence》。“鉴于我们在PGMs方面的经验，对于一个新平台而言，我们希望它具有竞争力，但又不指望其像数据中所显示的那样卓越——因为它已经远远超出了我们对它的期盼。”
Proton和HiSeq 平台在单核苷酸变异检测方面表现良好，但在插入缺失上却存在差异，出现某些问题。“这两个平台在检测插入缺失方面有利有弊。我认为，如果您只需在[生成数据]后进行仔细的搜集，则这两个平台足以满足您的需求”， Boland说。
NCI实验室最近配置了六台Ion Torrent PGM，四台Ion Proton，一台HiSeq 2000，一台HiSeq 2500 ，以及一台MiSeq。
开展研究后，研究人员于12月和1月生成了相关数据，并在2月的基因组生物学和技术进步会议（IS 2/26/2013）上提交了初步结果。目前，该实验室根据机器的可用性以及生成结果的速度采用HiSeqs和 Protons进行全外显子组测序。 实验室的多个项目涉及家族性外显子组研究，如果HiSeqs被预定完，则将转为采用Proton进行小型家族性外显子组研究，Boland表示。 “由于这两个平台的质量目前不相上下，如果我们从一个平台转向采用另一个平台，这不会给我们的研究人员带来任何困难”。 实验实验室目前主要采用Protons开展转录组测序研究，Boland说。
实验室采用任一平台进行全外显子组测序时，各样本的费用差额在$150以内，Boland表示，“在确定运行哪个平台时，价格不是主要的考虑因素”。
为进行对比，研究人员采用Ion Proton和HiSeq 2000对CEPH三元家族的外显子组进行了测序。为捕获外显子组数据，研究人员在采用Proton 时使用的是Life Tech的TargetSeq Exome v2，可包含50百万碱基序列；而在采用Illumina时使用的是NimbleGen SeqCap EZ Exome v3，其能捕获约64百万碱基序列。 研究人员将其分析限制在43百万碱基序列上，即两个外显子组捕获试剂的重叠部分。
采用Proton进行测序时，各样本至少生成9千兆碱基数据，其中80%的读数直指目标。为检测变异，通过Ion Reporter的标准管道运行数据。
采用HiSeq进行测序时，各样本至少生成11千兆碱基数据，其中66%的读数直指目标。使用GATK管道检测变异。
在共享外显子组中，采用Proton时，各样本平均检测到了约28,000个变异，而采用Illumina时为34,000个——两个平台共享了约3/4的变异。
两个平台在进行单核苷酸变异检测时产生的结果大幅重叠，远远超过了插入缺失的重叠部分。以代表样本为例，两个平台都检测出了约25,700个单核苷酸变异。 此外，仅Proton 检测出了1,100个单核苷酸变异，而仅HiSeq检测出了7,000个。
以相同样本为例，这两个平台共同检测出了约600个插入缺失，但是，Proton和HiSeq还分别检测了另外的880个和920个插入缺失。研究人员在对特定平台的插入缺失亚群进行分析时发现，“由于比对问题及/或均聚物序列，很多插入缺失呈现出假阳性”。
研究人员还将通过Proton、HiSeq和Complete Genomics 检测出的单核苷酸变异和插入缺失进行了比较，发现这三个平台检测出了66%的（或23,700个）单核苷酸变异，但是仅检测出了18%（总共530个）的插入缺失。
Proton检测出了830个特定于该平台的插入缺失；之后是Complete，为540个；最后是Illumina，为440个。科学家们得出结论，其分析“在检测较小的插入缺失时，识别出了各方法存在的主要差异，这给进一步提高技术测序及/或生物信息学算法提出了重大挑战”。
在 将采用Proton 和HiSeq得出的SNP基因分型与三个三元样本中的两个的SNP微阵列数据进行比较时，科学家们发现，经采用这两个平台，各样本表现出很高的一致性，高达99%，表明SNP检测具有较高质量。
研究人员还通过检测和分析读数比对，更加密切地关注特定平台变异的检测情况。
很多Illumina平台的特定单核苷酸变异为片段重复或简单重复。 研究人员指出，根据Proton的数据，可以发现单拷贝区的单核苷酸变异具有较低的覆盖率，因此Proton很可能遗漏了该等单核苷酸变异；但是Illumina的数据中也可能遗漏了SNP检测，该等检测在Proton的数据中“明显且清晰”。
Boland说，其采用两种不同的捕获试剂的原因在于，在Proton平台使用NimbleGen（罗氏）或Agilent（安捷伦）SureSelect捕获试剂时尚无任何“商业许可”协议。“我们的想法是，采用任何批准的东西，以便于人们从货架上选择产品并进行使用”，Boland说。由于仅对重叠区域进行了分析并仅使用了相同的DNA样本，“在我们看来，这样做是绝对有效的”。
在论文中，研究人员指出，较之HiSeq ，Proton的运行时间 “明显缩短”， 仅为11.5小时（包括数据处理的时间），而前者通常需要六天的运行时间。
自从开展该项研究后，也对Proton进行了改进。据Mike Lelivelt—Ion Torrent的生物信息学和软件产品主管说，由于提高了各芯片的输出性能，目前，客户可以采用各PI芯片同时对两个（而非一个）外显子组进行测序。
Mike Lelivelt在研究中声称，公司“对Proton系统用于外显子组测序的表现感到十分满意”，这表明“尽管对于各平台而言，进行准确的插入缺失检测仍然任重道远”，但是，“该等平台在单核苷酸变异检测方面已经遥遥领先”。Mike Lelivelt还指出，在所有变异中，插入缺失检测的比例要远低于单核苷酸变异检测。
Boland说，其小组目前正在开展其他的平台比较，此类平台关注于全转录组测序和扩增子测序。该小组还对特定平台的单核苷酸变异和插入缺失做了进一步分析，以探明其他平台遗漏该等单核苷酸变异和插入缺失的原因。 Boland计划于秋季提交其研究的最初结果。