FDA Sci论坛：经典AD实验室质谱法与新一代新兴分析技术（Rebel）的比较

摘要

分析仪器对于评估产品质量和生物药产品开发过程控制至关重要，它在制药行业中应用于各种应用，如与产品质量相关的研究，如单克隆抗体中的糖基分析和细胞培养基中氨基酸和代谢物浓度。尽管液相质谱（LC-MS）具有灵活应用解决复杂问题的能力，但其实验开发通常比其他分析方法耗时更多。最近，如908 Devices的REBEL等新型分析设备采用了操作简化用户友好的方法，以替代传统劳动密集型LC-MS。REBEL是一种能够快速定量氨基酸和其他重要代谢物，实现全面分析和高通量样本测试的仪器，而我们的目的是比较这一代分析平台（908 Devices的REBEL）与经典LC-ToF MS方法，并评估数据质量。

引言

生物制药公司越来越关注培养基成分的理解和产品的质量，为了提高生产效率，他们必须面对的是耗时的传统方法。细胞系开发和优化是过程策略的重要组成部分。传统上，使用液相质谱（LC-MS）进行培养基营养和代谢组学研究，这需要高度的技术专长，且耗时较长。然而，优化实验需要对生物反应器参数的实时监测、过程分析和产品质量属性的结果来支持。908 Devices的全自动培养基组分分析仪系统，即REBEL，作为一种新型分析仪器，因其快速分析和简单操作而受到生物制药行业的广泛关注。

本文介绍REBEL替代传统LC-MS方法，在生物反应器培养基监测方面的最新进展。REBEL进行培养基分析的主要优势包括无需衍生化即可分析、快速的分析时间和简单的操作。然而，由于该仪器是市场新秀，其分析技术描述尚不充分。因此，我们采用Waters的非衍生化和正相色谱方法，使用BioAccord RDa飞行时间（ToF）LC-MS进行培养基分析的比较。我们的目标是展示REBEL和RDa培养基分析结果的可比性，并探讨两种分析仪器方法的成本效益。此外，我们将在实验室中建立这两种分析方法，以便在未来代谢研究中评估过程变化、补料策略及其对产品质量的影响，从而深化我们对关键过程参数及其对药物产品质量特性影响的理解。

结果与讨论

图1. 生物反应器1（顶部）和2（底部）的68到227小时的氨基酸浓度趋势，pH 设定在7.1。样品由Waters BioAccord RDa LC-MS（蓝色）和REBEL培养基分析仪（红色）进行分析。

图2. 生物反应器3（顶部）和4（底部）的68到227小时的氨基酸浓度趋势，pH设定在 7.3。样品由Waters BioAccord RDa LC-MS（蓝色）和REBEL培养基分析仪（红色）进行分析。

表1：REBEL和LC-MS之间的比较，其中+代表所需的技术专业知识或需要的数量。

我们能够成功地使用REBEL和BioAccord RDa LC-MS上的初步方法运行所有样品，从而在UNIFI上创建一种处理方法，以在我们的RDa LC-质谱分析中从标准校准曲线中识别、质量确认和量化所有氨基酸。Rebel导出了所有氨基酸的计算浓度，并创建了手动数据透视表来说明左侧显示的结果。生物反应器复制品1和2在pH 7.1设定值下运行，并在整个培养物中显示出相似的氨基酸趋势（图1）。类似地，生物反应器复制品3和4在pH 7.3设定值下运行时相互共享趋势（图2）。生物反应器1-4的氨基酸趋势以蓝色表示用于BioAccord RDa LC-MS分析，以红色表示用于REBEL分析。REBEL和RDa LC-MS数据显示所有反应器的氨基酸趋势相当。对于样品制备，与RDa LC-MS的1:500相比，REBEL方法的样品稀释比例为1:100，这表明RDa LC-MS的灵敏度至少是REBEL的五倍。然而，我们可以看到，RDa LC-MS中204和227小时氨基酸浓度的较晚时间点远高于REBEL。这很可能是因为这些值是在标准曲线之外发现的，因此，外推浓度会导致计算误差。REBEL只能分析33种分析物，包括22种氨基酸、5种维生素和6种生物胺，其中RDa是Tof LC-MS，可以分析这些和其他未知的分析物。表1列出了REBEL与传统LC-MS的比较，其中REBEL易于使用，不需要太多时间或精力来操作，但牺牲了在其范围之外进行分析的能力，并且相比于TOF质谱灵敏度略低。传统的LC-MS方法可以以更好的灵敏度进行专门优化，但这需要更高水平的技术技能。REBEL为自动化分析提供了包罗万象的试剂盒，但每个样本的试剂盒分析成本远高于LC-MS方法所需的材料。总体而言，REBEL在其分析范围内以更高的运行成本/表现相对较好，但其易用性和快速分析是推进实时过程优化的主要优势。

材料与方法

我们从Sartorius的AMBR250生物反应器（VRC01 CHO细胞培养）中采集每日样本，进行了一次10天的批次实验。重复的生物反应器1和2的pH为7.1，生物反应器3和4的pH为7.3，其余保持一致。样本经过处理和过滤，用于分析细胞培养基反应液的游离氨基酸浓度。

REBEL的培养基分析试剂盒（908 Devices）提供了BGE溶液和稀释液，还有预制好的标准品。样品用稀释液稀释100倍。所有的浓度数据以.csv文件形式输出。而BioAccord RDa（Waters）的LC-MS方法是基于Waters的应用指南调整的，以适应Accuilty Patrols作为LC系统的特定设置。氨基酸细胞培养标准品（Waters）根据说明书新鲜制备，每个氨基酸的6点校准曲线为5uM-0.5uM，除了2.5uM-0.25uM的胱氨酸。新鲜制备样品，并用0.1%甲酸以1:500稀释。用UNIFI（Waters）处理获得的LC-MS数据，以创建标准曲线，识别和量化氨基酸浓度。所有样品（REBEL和BioAccord RDa）均进行三次重复。

结论

我们的初步RDa LC-MS方法表明，REBEL细胞培养基分析仪收集的数据与CHO细胞培养生物反应器具有可比性。目前，基于REBEL的实验结果，我们正在优化RDa LC-MS方法，使用8点校准曲线（范围0.1-30uM），以捕捉所有氨基酸浓度。一旦使用最终确定的RDa LC-MS方法对所有样本进行分析，将进行进一步的方法比较和统计分析。我们将评估零假设的方法，即用REBEL进行的测量与用RDa LC-MS进行的测量不同，然后寻找基于数据的证据，证明测量是相同的。如果数据支持否定零假设，那么我们可以得出结论，这些仪器在每次比较的代谢物测量中都具有同等的性能。未来的研究将进一步测试REBEL评估代谢对产品质量影响的能力，例如温度变化对代谢产物利用的影响及其对微生物反应器中聚糖谱的影响。由于细胞代谢可以在代谢产物的利用和浓度方面产生共线性，我们将使用多变量数据分析（MVDA）来评估细胞代谢及其对聚糖谱的影响。REBEL的易用性和快速分析的优势允许更大的样本通量，同时保留与传统LC-MS方法相似的数据质量，以快速推进我们对关键质量属性的影响的理解，从而提高关键工艺参数的理解。