【应用分享】抗体生产的重要参数：葡萄糖、氨基酸

上海汉尧

2023/07/12 16:34

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近几十年来，重组治疗蛋白的年度全球市场已大幅增长。特别是单克隆抗体（mAbs），它为癌症、炎症疾病、传染病和自身免疫性疾病提供了新的治疗途径，在监管审批和全球销售方面都取得了显著的成功。中华仓鼠卵巢（CHO）细胞更是被广泛用于生产重组抗体，因为它们生长旺盛，并且有可能产生具有类似于人类的糖基化模式的非免疫原性抗体。糖基化作用在治疗性IgG的生物学特性中起着关键作用，例如，效应物功能、免疫原性、稳定性和清除率。因此，糖基化的控制对于满足监管要求和质量合规至关重要。每个糖基化位点上的聚糖结构的异质性可以根据其生物合成阶段而变化，从较不成熟的形式（例如，非糖基化和高甘露糖形式）到更成熟的类型（例如，半乳糖基化或唾液酸化形式）。

而糖酵解和谷氨酰胺代谢是CHO细胞的关键代谢途径。通过糖酵解，CHO细胞消耗葡萄糖作为能量生产的主要碳源，并产生乳酸作为最常见的代谢副产物。谷氨酰胺裂解是CHO细胞吸收有机氮进行生物质合成的主要途径，同时释放铵离子作为主要副产物。补料分批培养（fed-batch）在工业上广泛用于生产重组抗体。在fed-batch中，定期相应的补料培养基/葡萄糖可提供足够的营养，来支持细胞生长和代谢，使高密度细胞存活并表达产物，延长存活能力和诱导高产。然而，细胞副产物的积累可能会抑制细胞生长，减少抗体产生，并给抗体糖基化带来不利影响。

氨基酸浓度也是重要的影响因素之一，如培养物中与细胞生长和IgG生产力有关的Leu和Arg水平需要得到很好的控制。具有最高消耗率的氨基酸与产生的IgG中存在的最丰富的氨基酸相关，因此在培养过程中需要确保足够的可用性。个案分析对于理解培养基和工艺优化对糖基化的影响是必要的。了解细胞生长、细胞代谢、IgG合成和糖基化之间的相互作用，以及这些因素在代谢水平上如何在不同细胞系和培养基组成之间变化，将有利于生物过程优化和培养基开发。

美国908devices公司针对培养基开发对于早期工艺开发的重要性推出了两款产品，一款是针对常规的两种重要参数葡萄糖和乳酸的在线生化分析仪Maven，采用透析膜和生物（酶）传感器的技术原理，其中选择性透析膜在确保罐内无菌环境与非严格无菌的运输缓冲液体系不交叉的情况下实现只透过葡萄糖和乳酸小分子，通过缓冲液的运输到达测量单元，达到不采样分析的效果。另一个技术核心，测量单元，使用的生物（酶）传感器对分析物具有高度特异性，低浓度下依旧可以保持有效的测量精度。对于小体积的发酵/培养，这种不损失样品的采样方式在实现高频次采样的同时还降低了污染风险。最高2分钟一次的测量频率，可以达到实时监测葡萄糖乳酸的效果，尤其适用于在早期工艺摸索，研究葡萄糖的代谢情况，从而制定fedbatch的补料策略或者实现自动补料。

另一款产品REBEL，作为专用的培养基成分分析仪，采用微流控芯片技术（CE-MS 毛细管电泳-质谱联用原理），帮助研发人员摆脱传统的分析表征流程（步骤多、耗时长），对于REBEL，样品仅需微升级别的消耗量即可完成多次分析（<30ul），单次分析不到10分钟就能完成>30种成分（图2）的浓度分析，操作和样品制备流程极为简易，相比传统流程兼顾效率和成本。