【文献解读】人造肉研发关键技术——无血清培养基的成分影响

“clean meat”作为日益增长的全球人口的膳食蛋白质替代来源，它的成功商业化将需要开发高效、廉价的无血清细胞培养基。众所周知，与基于血清的培养基相比，无血清培养基引发不同的细胞生长行为，但全面探索无血清培养对培养肉相关细胞类型的营养需求的影响的数据尚未报道。Edward N. O’Neill等人对在Essential 8无血清培养基和常规含血清培养基中培养的C2C12细胞和培养基成分进行了分析。

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实验前细胞的制备：

细胞：C2C12细胞；

培养基：40%的DMEM、40%的Ham’s F10、20%的FBS和另外的2.5ng/mL重组人碱性成纤维细胞生长因子；

培养方式：将细胞维持在组织培养物处理的（TC）聚苯乙烯培养皿上，以5000个细胞/cm²接种，并使用Try-pLE Express在达到约75%汇合时传代。使用台盼蓝法通过血细胞仪进行计数；

培养条件：37°C和5%CO₂。

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实验方法：

将TC处理的聚苯乙烯六孔板用Matrigel涂布，使用0.15mg/mL蛋白质的稀释溶液进行常规薄涂布。将P10的C2C12细胞重悬于无血清Essential 8或PCGM培养基中，并以10⁵个细胞/孔接种，总体积为每孔3mL培养基。此后不久，将2μL Hoechst 33342核染色剂的浓缩储备溶液加入每个孔中，使孔中的最终浓度为0.2μg/mL。细胞接种后，将6孔板不受干扰地留在细胞培养箱中。在观察时间点，使用ImageXpress Pico高含量筛选显微镜系统对来自两个培养基组的三个重复孔的协同反应组进行成像。

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检测方法：

1.     葡萄糖、乳酸：HP 1100高效液相色谱（HPLC）系统与折射率（RI）检测器结合使用Aminex HPX-87H柱。

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2.     氨基酸：使用REBEL分析仪（908 Devices）测量新鲜培养基和废培养基中的氨基酸浓度。使用0.20μm无菌过滤器制备样品以去除细胞碎片，然后使用REBEL稀释剂稀释。通过微流体毛细管电泳和高压质谱（CE-HPMS）对每个样品进行一式三份的分析。根据迁移时间和质量自动识别分析物。

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3.     FGF2：使用人FGF2的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒。使用SpectraMax iD3多模平板读取器在450nm处读取96孔测定板中的最终比色吸光度。

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实验结果：

1.     细胞密度：通过在培养过程中每24小时记录一次每孔的细胞密度（图1），确定与传统含血清培养基相比，无血清E8培养基支持类似程度的细胞生长。E8细胞计数在第3天呈指数级增加，并更快地达到其最大值（高于PCGM培养基中的任何时间的细胞密度），但随后开始轻微下降，然后在第6天后显著下降（可能是由于细胞死亡和脱落增加）。PCGM细胞密度在第2天结束指数增长，但继续逐渐增加到第7天。

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图1 细胞密度的变化

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2.葡萄糖和乳酸浓度：数据（图2A和2B）表明，葡萄糖在两个培养基组之间的使用非常相似，直到第4天左右，尽管PCGM组中细胞持续生长，E8组中细胞数量减少，但PCGM的使用减慢，但E8的使用仍在继续。虽然PCGM中的初始乳酸盐浓度显著高于E8，但在七天的培养期内，两种培养基中乳酸盐积累的相对速率相似。

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3.FGF2的浓度：E8中的额外FGF2被用作旨在取代FBS功能的主要成分。数据（图2C）表明，在培养的3或4天左右，两种培养基中的FGF2浓度开始显著降低，这大致是相应细胞密度停止指数增长的时间。虽然在两种培养基类型的培养中，FGF2浓度在约5或6天时达到其最小可测量值，但此后细胞密度维持了至少几天。总体而言，两种介质类型之间的相对FGF2消耗模式没有显著差异。

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4.氨基酸浓度：（图2E）PCGM和E8之间每种氨基酸的大多数初始（D0）浓度相似，与它们的基础培养基配方一致。差异可能是由于PCGM中FBS成分的未知氨基酸图谱造成的。对于任何一种培养基，许多氨基酸浓度都没有随着时间的推移而显著降低，这表明它们没有被使用或被细胞代谢循环。对于一些氨基酸，E8培养基组似乎消耗的与PCGM中的细胞相比更快/更完全。例如，与PCGM中的谷氨酰胺和甘氨酸浓度相比，在培养的第4–5天，E8中谷氨酰胺和甘氨酸的消耗量显著增加。到第3天左右，E8中丝氨酸几乎完全耗尽，这是指数生长停止的时间。除此之外，除了精氨酸等少数氨基酸外，大多数氨基酸的利用总体趋势相似。

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图2 葡萄糖、乳酸、FGF2、氨基酸浓度的变化

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实验结论：

结果表明，C2C12成肌细胞系在E8中的表现至少与含血清培养基同样好（图1）。C2C12是一种永生化肌肉细胞系，在重要生理方面与成人干细胞不同，成人干细胞可能与Clean Meat更相关。因而，为了达到更好的加工效率，Clean Meat行业可能需要开发自己的永生化细胞系，如C2C12。然而，来自不同物种和谱系的Clean Meat相关细胞的培养基需求之间存在显著差异，针对每种细胞类型摸索、优化培养基成分是必要的。

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该实验对葡萄糖和乳酸浓度动力学的检查（图2A和B）展示了培养基类型对细胞代谢行为的有趣影响。有血清和无血清培养基的葡萄糖利用率和乳酸积累基本相似，表明细胞在不同培养基中的代谢活性没有显著差异，并表明无血清培养基可能不会直接影响葡萄糖代谢。然而，血清中存在的许多额外生长因子、细胞因子和其他信号分子中的一些的复杂相互作用可能也值得进一步研究。

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氨基酸动力学分析（图2E）表明，许多氨基酸不会被生长在含血清或无血清培养基中的细胞显著消耗，因此可能不必包含在优化的Clean Meat培养基中，或者至少不需要包含如此大量的氨基酸。然而，实验结果也揭示了在两种类型的培养基中生长的细胞的氨基酸代谢之间的有趣差异。谷氨酰胺利用率的差异表明E8培养基中的细胞正在经历更高的谷氨酰胺裂解率，直到谷氨酰胺在第4天左右完全耗尽；E8中天冬氨酸和丙氨酸（谷氨酰胺分解的代谢产物）直到第4天的低消耗率支持了这一观点。血清与无血清培养基之间氨基酸代谢的的生化差异很有趣，值得进一步探索。

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虽然两种培养基之间的总体FGF2利用趋势没有显著差异。与PCGM相比，在无血清E8培养基中生长的细胞更多地利用FGF2，这可能是由于缺乏血清中常见的其他生长促进因子，使得FGF2作为SFM中生长的“底物”比其他情况下更重要。E8培养液中的FGF2越多，E8中获得的总细胞数越高。然而，这种程度的增长是否决定了Clean Meat培养基中需要高水平的昂贵的生长因子仍然是一个悬而未决的问题。

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表征大多数Clean Meat相关细胞类型的代谢需求方面完成的工作相对较少，因此对它们做出的许多更具体的代谢假设都源于对这些细胞类型在早期研究中如何表现的了解，而这些研究通常都使用含血清的培养基。这些假设可能不利于将细胞转化为完全无血清和化学定义的培养基的总体容易性和成功性。为各种细胞类型适当优化无血清培养基，以最低成本实现最高效的Clean Meat生物工艺，可能需要大量的时间和精力。也许，可以创建Clean Meat的细胞系，从而实现更大的多功能性，这可能是研究Clean Meat细胞/工艺的实验人员未来值得追求的目标。

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原文：https://doi.org/10.1016/j.fufo.2023.100226

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