EVIDENT共聚焦/超分辨助力Nature Communications发文揭示应激颗粒亚型鉴定范式

应激颗粒（SGs）是真核细胞在应对缺氧、热休克、病毒感染和氧化应激等各种应激时形成的无膜 RNA 颗粒1。SGs 的形成会导致细胞新陈代谢的重新规划、翻译的抑制以及正常细胞信号的改变，从而帮助细胞存活。SG 是通过一种称为液-液相分离（LLPS）的物理过程形成的，其中包含许多蛋白质，包括小核糖体亚基、翻译起始因子、翻译受阻的 mRNA 和 RNA 结合蛋白2。最近发现了一个由 36 个 SG 蛋白组成的核心 SG 网络，其中 G3BP1/2 是中心节点3。这些蛋白对调节 SG 的组装和功能至关重要。在许多病理情况下，如病毒感染4-8、神经退行性疾病9-11和癌症12、13等，SG的组装和分解失调都会发生，这突出了SG在人类疾病中的重要性。最近的研究发现，不同类型的应激会诱导不同的 SG 亚型，这些亚型在组成、组装和解体的动态以及细胞功能方面各不相同14。例如，亚砷酸钠或热休克处理会诱导形成典型的 SG，这种 SG 更具有活力，能起到促进生存的作用15。与此相反，亚硒酸钠等化疗药物或紫外线照射会导致非典型 SG 的形成，这种 SG 的动态性较弱，对细胞有促进凋亡的作用15、16。尽管应激特异性 SG 亚型的概念正在形成7、15、17-19，但它们不同的蛋白质和 RNA 组成及功能在很大程度上仍未得到探索。

2024年5月15日，四川大学生物治疗全国重点实验室贾大课题组与合作者在Nature communications杂志( IF=16.6 (2023) / JCR分区: Q1 )在线发表了题为“TRIM25 predominately associates with anti-viral stress granules“ 的研究论文。该工作利用 G3BP1 邻近蛋白生物素化标记实验发现 TRIM25 是抗病毒 SG 的有效标记物。课题组成员发现 TRIM25 会独立发生 LLPS 现象，而 dsRNA 的存在会显著增强这种反应。Poly(I:C)处理和RNA病毒感染都会引发TRIM25和G3BP1的共相分离，从而显著提高TRIM25对底物的泛素化活性，其中许多底物都定位于SGs中。TRIM25和G3BP1的共相分离对激活RIG-I信号通路和限制RNA病毒感染至关重要。该研究不仅为抗病毒信号通路的调控提供了新的见解，而且为研究应激特异性 SG 亚型的组成、动态和功能建立了一个研究范式。

该研究首先采用了一种邻近生物素化标记（BioID）方法（图1）来鉴定poly(I:C)刺激下的 G3BP1 相互作用网络。在 937 个差异蛋白中，有 181 个属于以前鉴定的 SG 蛋白成分，包括许多 SG 核心蛋白，如 HDAC6 和 DDX3X。有趣的是，TRIM25在所有蛋白中增加最为显著，它是一个泛素化依赖性抗病毒先天免疫反应的驱动蛋白，经 poly(I:C) 处理后富集了 130 倍（图1）。这意味着，poly(I:C) 处理会刺激 TRIM25 被招募到 SG（即抗病毒 SG）中。

图1. G3BP1的邻近蛋白标记组鉴定到TRIM25是受poly(I:C)处理富集的SG核心蛋白

(A) G3BP1 BioID 方法与基于 TMT 的定量蛋白质组学相结合的示意图。(B) 如(A)中所确定的，由 poly(I:C) 处理诱导的 SGs 核心蛋白列表。

随后，研究人员为了探究poly(I:C)处理导致的TRIM25被招募到SG中是否有特异性，使用各种应激诱导剂，系统地处理了过表达GFP-TRIM25的HeLa细胞： RNA病毒入侵（仙台病毒，SeV）、外源dsRNA应激（poly(I:C)）、氧化应激（亚砷酸钠）、ER应激（毒胡萝卜素）、翻译抑制（嘌呤霉素）、蛋白酶体抑制（MG132）、能量耗竭（CCCP）、热休克和渗透压应激（山梨醇）。并使用四川大学华西第二医院技术平台Olympus FV3000激光共聚焦显微镜检测TRIM25与G3BP1颗粒的共定位状态。不出所料地，所有诱导剂都轻易地诱导 G3BP1 阳性颗粒的形成。有趣的是，虽然在多种条件下都能观察到 TRIM25 点状聚集，但只有当细胞感染 SeV 或用 poly(I:C) 处理时，TRIM25 和 G3BP1 才会形成共定位的点状物（图2）。(奥林巴斯FV4000激光共聚焦显微镜现已发布)

图2. TRIM25仅在poly(I:C)和SeV处理下与G3BP1共定位

(A) 具有代表性的荧光显微镜图像显示了在各种应激条件下 TRIM25 与 HeLa 细胞中内源性 G3BP1 的共定位。(B) TRIM25 和 G3BP1 病灶之间的最短距离。在 HeLa 细胞中，各种应激类型如（A）所示。在所有应激类型中，Sev 感染和 poly(I:C) 处理导致的距离最短。

然后，为了确定 TRIM25-G3BP1 相互作用是如何促成其共相分离发生的，研究人员构建了一系列TRIM25截短突变体，并将“PTFG”鉴定为TRIM25结合G3BP1所需的最小氨基酸片段（数据未展示）。将 mCh-TRIM25（WT 或 ∆PTFG ）和 GFP-G3BP1 共转染到 HeLa 细胞中，并四川大学生物治疗全国重点实验室平台Olympus Spin SR转盘共聚焦快速成像和快速超高分辨率系统进行活细胞成像，观察 TRIM25 液滴和 SGs的动态特征。TRIM25 WT 和 G3BP1 液滴在poly(I:C) 转染后不到 5 小时就出现了，并显示出很强的共定位（图3）。相比之下，TRIM25 ∆PTFG 液滴的形成明显延迟，直到 poly(I:C) 处理后 8 小时才被观察到（图3）。TRIM25 ∆PTFG 与 G3BP1 之间的共相分离倾向远低于 TRIM25 WT 与 G3BP1（图3）。免疫荧光实验进一步证实了这些观察结果（图3）。

图3. PTFG序列是TRIM25与G3BP1形成共相分离所必需的

(A) 转染 poly(I:C) 后 G3BP1（绿色）和 TRIM25 WT 或 ∆PTFG （红色）点状颗粒形成的延时显微照片，以及转染后 6 小时或 10 小时斑点的放大图像。比例尺：10 µm。插图：白色框内区域的放大图。(B) TRIM25 的 PTFG 基序是与 HeLa 细胞中的 G3BP1 共定位所必需的。细胞转染了 GFP-TRIM25 ∆PTFG 而不是 TRIM25 WT。比例尺：10 μm。

最后，研究人员发现TRIM25 和 G3BP1的共相分离对调节 RIG-I 信号通路至关重要。使用定量 RT-PCR (qPCR) 方法测定干扰素通路中多个关键基因的 RNA水平。研究人员发现经 poly(I:C) 处理后，TRIM25 WT 能显著增强 IFNα、IFNβ、IFNγ 和 ISG56 的表达。相反，转染 TRIM25 PTFGAAAA或∆PTFG后，这些 IRF3 依赖性基因的表达则不被增强（图4）。

图4. TRIM25-G3BP1 共相分离激活RIG-I介导的先天免疫

(A-D) 用 TRIM25 WT、TRIM25 PTFGAAAA或∆PTFG转染HEK293T细胞，然后用poly(I:C) 处理 12 小时。用qPCR测定IFNα (A)、IFNβ (B)、IFNγ (C)和ISG56 (D)的 mRNA 水平。

综上，本文作者通过邻近标记G3BP1蛋白互作组结合活细胞成像与无膜细胞器的亚细胞定位分析的方法将TRIM25鉴定为应激颗粒中承担抗病毒功能的重要成分。该工作构建了一个研究应激颗粒亚型的研究框架，有助于开发更有针对性的疗法来治疗与应激有关的疾病。

本文中多色荧光标记的细胞图像都是采用Olympus激光扫描共聚焦FV3000拍摄。FV3000的全真光谱技术可以自由调整标记荧光信号的收集波段，并有效防止不同标记之间的荧光串扰，帮助用户获取更加真实可靠的数据。另外，本文还利用FV3000观察了活细胞中的G3BP1液滴以及通过FRAP实验验证了其相分离特性。FV3000灵活高效的龙卷风光刺激模式以及追踪运动中的液滴并分析其漂白区域荧光强度变化的功能，是帮助用户进行相分离 研究的利器。另外，文章中的活细胞实验采用了Olympus转盘共聚焦超分辨系统SpinSR，其高速、高分辨率和低光毒性的特点，适合对快速动态变化的活细胞进行长时程观察。

四川大学生物治疗全国重点实验室贾大研究员与四川大学基础与法医学院Peng Bai为本文的共同通讯作者。硕士生尚泽华，博士生张思韬、王瑾瑞为本文共同第一作者，苏州大学博士生周莉莉、四川大学华西生物治疗国重创新班本科生张欣悦也为本研究做出重要贡献。本研究还得到了周芳芳、杨培国、Daniel D. Billadeau、张令强等教授的大力支持，并得到了李丕龙教授的指导和帮助。

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