华南理工大学杨晓泉等：采用等温滴定量热法、耗散型石英晶体微天平和Langmuir单层膜制备技术研究大豆7S球蛋白多肽与细胞膜模型之间的相互作用

摘要：为了了解大豆7S球蛋白降胆固醇作用的内在分子学机理，本文系统性研究了胃蛋白酶释放多肽（7S肽）与由二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、二油酰磷脂酰胆碱（DOPC）和胆固醇（CHOL）组成的细胞膜模型之间的相互作用。结果表明： 7S-肽主要通过范德华力和氢键与DPPC / DOPC / CHOL脂质体结合，而且胆固醇浓度越高，结合亲和力越强（例如，当DPPC / DOPC / CHOL = 1：1：0时，结合率= 0.114; 当DPPC / DOPC / CHOL = 1：1：1时，结合率= 2.02）。LB膜等温压缩研究结果表明，7S-肽的加入增加了DPPC / DOPC / CHOL单层磷脂膜的流动性和脂筏尺寸。 胆固醇的存在加速了脂筏上7S-肽的积累，这可以作为肽发展形成富含β-折叠结构的平台。这些结果使我们可以推测7S-肽可能通过改变肠上皮细胞的膜组织间接影响膜蛋白功能。

关键词：7S-肽，细胞膜模型，脂质体，Langmuir单层膜，相互作用

测量方法：                                                                                                                      

耗散型石英晶体微天平（QCM-D）：                        

本文使用耗散型石英晶体微天平QCM-D（瑞典百欧林科技有限公司，QSense）深入研究了7S-肽和脂质体之间的相互作用。在测试前，用pH7.4 PBS缓冲液将7S-肽和脂质体稀释至0.1％（w / v）的浓度。在25℃的温度下，依次加入PBS缓冲液（基线，10分钟），脂质体悬浮液（60分钟），PBS缓冲液（冲洗，10分钟），7S-肽溶液（40分钟）和PBS缓冲液（冲洗，10分钟），记录实验期间金涂层石英晶体芯片的归一化频率变化（Δ f）和耗散值变化（ΔD）。注射速率为0.1mL / min。在每次实验之前和之后，将芯片在硫酸 - 过氧化氢（3：1，v / v）混合溶液中超声处理10分钟，用Milli-Q水洗涤，然后用氮气干燥。微量天平部分也用Milli-Q水冲洗并用氮气干燥。所有实验均进行三次重复。

LB膜分析仪：

检测7S-肽与Langmuir脂质单层膜之间的相互作用，在25℃下测量表面压（Π） - 面积（A）等温线，通过使用称重方法校准的铂Wilhelmy板（周长39.44mm，KSV，芬兰）研究7S-肽和脂质Langmuir单层之间的相互作用。本研究中使用芬兰KSV NIMA 生产的Langmuir液 - 液槽（总面积为40176mm2），并配备两个亲水性Delrin滑障。在测量之前，将300mL pH 7.4 PBS缓冲液作为子相倒入Langmuir槽中，通过抽吸、清洗和压缩液体界面直至表面压力低于0.5mN / m，确保无表面活性剂污染。将DPPC / DOPC / CHOL摩尔比分别为1：1：0,1：1：0.2和1：1：1的三元混合磷脂溶于氯仿/甲醇混合物中，混合体积比为2：1，用Hamilton注射器将一滴40μL样品（1mg / mL）缓慢滴在亚相界面上。待溶剂蒸发和脂质扩散20分钟后，将脂质/肽摩尔比分别为1：0,1：0.12,1：0.40和1：0.78的7S-肽溶液滴在子相上。平衡30分钟后，两个压缩滑障开始以8mm/min的速率压缩。所有实验均进行三次重复。

形态学观察，在Langmuir槽上同时安装了一个自动镀膜装置，用于将Langmuir- Blodgett (LB)单分子层沉积到固体基底上。当表面压力达到预期值时，通过垂直拉力以2mm /min的恒定速度将LB单层膜转移到一个干净的玻璃载玻片或一个新切割的云母片上。在空气中干燥1小时后，用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)和原子力显微镜(AFM)观察得到的薄膜。

图1：7S-肽和混合磷脂脂质体之间相互作用的Δf -t和ΔD-t图，其中DPPC / DOPC / CHOL摩尔比分别为1：1：0（A）和1：1：1（B）。 时间点（i），（ii），（iii）和（iv）分别对应于脂质体添加，PBS缓冲液冲洗，7S-肽添加和PBS缓冲液冲洗。 所示数据均来自第三倍频（n = 3）。

图2：表面压（Π）——单层的面积（A）等温线，DPPC / DOPC / CHOL摩尔比分别为1：1：0（A），1：1：0.2（B）和1：1：1（ C），脂质/ 7S-肽的摩尔比分别为1：0.00,1：0.12,1：0.40和1：0.78。

单层的表面压（Π） - 静态弹性模量（E0）等温线，DPPC / DOPC / CHOL摩尔比分别为1：1：0（A'），1：1：0.2（B'）和1：1：1 （C'），脂质/ 7S-肽的摩尔比分别为1：0.00,1：0.12,1：0.40和1：0.78。

以上成果发表在Agric. Food Chem.上（2018.4.10），更多详情请阅读论文原文：https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021%2Facs.jafc.8b00414