如何减少在PCR检测中的假阳性风险

对于大量进行PCR的实验室来说，移液器的污染造成的假阳性并不是一个罕见的情况。

PCR尤其是RT-PCR技术已经逐渐成为疾病诊断的标准方法。如近期流行的新冠（COVID-19）疫情，RT-PCR结果即为诊断标准之一。对于PCR检测，由于实验室设备的污染造成的假阳性结果也不容忽视。尤其是在样本量极大，PCR仪连续工作期间，检测间往往都是封闭环境，气溶胶弥漫，仪器极易污染。而移液器往往是离样品最近，使用最频繁的仪器，不论是吸液过程中，还是在操作环境中，都非常容易被污染。污染的移液器可能会将污染的样品或核酸引入后续样品或者PCR反应体系中导致检出信号而出现假阳性结果。

       我们以德国BRAND 的Transferpette^® S移液器为例，介绍如何清洁移液器以减少移液器污染造成的假阳性风险。德国BRAND 的Transferpette^® S移液器具有易于拆卸维护的优点，配件更换容易，并具有易校准技术，无需工具即可进行移液器校准。并且Transferpette^® S移液器可以整支121 ^oC高压灭菌，尤其适合用于PCR实验。

移液器污染容易造成PCR实验假阳性风险的部分主要为下半支，污染分为两个类型：1. 机身外部的污染。通常由于离心，震荡，或者PCR加热造成气溶胶弥漫在实验环境中，沾染在机身外侧。或者在操作时如果不小心机身外侧接触了离心管的内壁，可能会造成移液器污染。在后续实验中可能不小心触碰样品管，离心管等可能会造成假阳性风险。2. 吸液时倒吸或者吸液的气溶胶污染。如果操作样品时未使用滤芯吸头，并且发生误操作，致使样品倒吸入移液器，没有及时清理，可能会污染后面的样品造成假阳性风险。吸液时气溶胶的污染也不可小觑，以20 μl移液器为例，在室温20 ^oC, 相对湿度为约60% RH时，吸液时的蒸发率可达到0.046 μl/s,相当于每秒蒸发0.23%的总移液体积。这种情况下如果没有使用滤芯吸头，不可避免蒸发的液体裹挟着样品会进入移液器下半支，并在后续的操作中吹入后续的样品中造成假阳性风险。

发生倒吸或者误碰样品管内壁后立刻停止操作进行清洁。气溶胶的污染可以通过定时清洁来减少。

接下来介绍如何拆卸与清洁德国BRAND 的Transferpette^® S移液器：

第一步，使用75%乙醇或异丙醇擦拭移液器外表面进行基础清洁与消毒

第二步，旋转下半支卸下下半支，通过旋转拆出活塞（I），弹簧密封圈（II），吸头锥套筒(III)，以及弹吸头套筒(IV)。

第三步，所有部件置于75%乙醇或者异丙醇中浸泡30分钟。取出用去离子水冲干净。

第四步，将所有部件置于含有去垢剂的超声波洗涤仪内超声清洁10分钟，取出用去离子水冲干净。

第五步，视核酸污染情况严重程度，吸头锥套筒，活塞等配件可置于甘氨酸-盐酸缓冲液（pH约2.0）中浸泡过夜。取出后用去离子水冲洗干净。甘氨酸-盐酸缓冲液配置方法：取30.6 g NaCl,39.2 g 甘氨酸，加去离子水定容至523 ml，加1 N HCl 477 ml,配置成10 x缓冲液。使用时按1:10稀释。严重污染的密封圈应更换。

第六步，部件晾干后，为活塞与密封圈涂上原装硅油。

第七步，按照第二步相反的方向旋转安装上移液器即可。

对于具有感染性污染的移液器，为了人员安全，操作全程应佩戴如手套、口罩、护目镜等防护用品，超声时应盖上盖子，并在超声清洁后将移液器于灭菌锅中121^oC 灭菌20分钟，再进行后续清洁。有时会为了减少感染风险，将高温灭菌操作为第一步进行，注意移液器机身内外如有倒吸凝结的污垢，未清洁的高温灭菌操作可能不能实现完全消毒，并可能损坏移液器。

 移液器机身内外如有倒吸凝结的污垢，未清洁的高温灭菌操作可能不能实现完全消毒，并可能损坏移液器。