技术干货 | 5分钟学会细胞冻存技术

目前，细胞冻存主要的技术为液氮冷冻法，实际冻存过程中，需要进行梯度温度冻存，并加入适量的保护剂以保证细胞内外的水分不会形成冰晶造成细胞的损伤或死亡。

培养基的颜色可以指示细胞是否生长过盛（比如偏黄就说明细胞长的太过）；而培养基出现浑浊情况往往是指示有污染存在，此时是不宜冻存的。

通常情况下，新复苏的细胞建议在2周左右进行冻存，若连续培养超过二个月，性状大 概率会发生一些改变，此时的细胞也不适宜冻存。

冻存时，每只冻存管内细胞最佳浓度为5x10^6个/ml—1x10^7个/ml，高密度或者低密度对细胞成活率都有一定的影响。细胞数目不足时，不建议冻存细胞。

细胞被消化离心、去上清收集细胞沉淀后，往往需要用冻存液进行重悬并转移至冻存管。冻存液中一般含有渗透型的保护液如甘油或10%的二甲基亚砜（DMSO）和10%-90%胎牛血清。

细胞内外主要成分都是水，若不加保护液直接冻存，细胞内外的水分会凝结成冰晶，引发细胞内源性的机械损伤。细胞内水分凝结导致的细胞脱水，也会使得胞内pH值改变、蛋白变性、细胞内器官功能的丧失乃至核内DNA损伤，最终极有可能导致细胞的死亡。

而冻存液往往都是易溶解的小分子物质，具有细胞渗透性，可以穿过细胞膜，进入细胞内，降低冰点，同时又可以提高细胞膜对水的通透性，使得细胞内水分渗出到细胞外，从而减少细胞内冰晶的形成。

冻存液中的另一个主要成分是胎牛血清。由于冻存中的细胞仍旧有微弱的新城代谢，在冻存液中加入血清，可以为细胞提供营养。同时，血清中富含的蛋白等大分子物质可以对细胞有较好的保护作用。实验证明，血清在冻存液中的高比例，有利于提高细胞活力。因而，在冻存过程中可以使用90%的血清加上10%的保护液进行细胞保存。对于常见的易培养细胞系10%到20%的血清再加上一定量的完全培养基和DMSO也可以很好的对细胞进行保存。

冻存管置于4℃ 10 min → -20℃ 30 min → -80℃ 16-18 小时（或过夜，最长放置时间不要超过一个月）→ 转移至液氮长期储存。

液氮（Liquid nitrogen）是液化的氮气，是生命科学研究和医药行业常用的冷冻储存介质，具有以下理化性质：

因而，在操作液氮罐时，需要注意以下安全使用规范：