紫外/可见分光光度计的使用原理和方法

1.紫外可见分光光度计基本工作原理科丰恒业 紫外可见分光光度计和红外光谱仪相似，利用一定频率的紫外--可见光照射被分析的有机物质，引起分子中价电子的跃迁，它将有选择地被吸收。一组吸收随波长而变化的光谱，反映了试样的特征。在紫外可见光的范围内，对于一个特定的波长，吸收的程度正比于试样中该成分的浓度，因此测量光谱可以进行定性分析，而且根据吸收与已知浓度的标样的比较，还能进行定量分析。 2.紫外分光光度计特点和主要用途 紫外-可见光谱仪涉及的波长范围是0.2－－0.8微米（对应波数50000-12500厘米-1），它在有机化学研究中得到广泛的应用。通常用作物质鉴定、纯度检查，有机分子结构的研究。在定量方面，可测定结构比较复杂的化合物和混合物中各组分的含量，也可以测定物质的离解常数，络合物的稳定常数，物质分子量鉴别和微量滴定中指示终点以及在高效液相色谱中作检测器等。 紫外分光光度计的工作波长在200～1000nm之间，其波长范围涵盖紫外光（200～400nm）、可见光（400～750nm）及近红外光（750～1000nm）。在紫外光区（200～350nm）测定时必须用石英杯。 3.分光光度计的基本原理及种类 分光光度计是理化分析中最常用的仪器。它的基本原理是建立在光与物质相互作用的基础上,当光子和某一溶液中吸收辐射的物质分子相碰撞时,就发生吸收,测量其吸光度值的大小可反映某种物质存在的量的多少。光的吸收程度与浓度有一定的比例关系,这就是著名的比直定律。该定律成立的必要条件是单色光(单一波长光)照射样品。为了使该定律具有良好的线性,对测量浓度有一定的范围要求。也就是吸光度值控制在0.2～0.7之间,并且要求单色光垂直照射样品,试样要均匀。一台性能优良的分光光度计,必须有一个高性能的光路系统即单色仪。单色仪有两类:一类是以玻璃三棱镜为色散元件组成;另一类是由光栅为色散元件组成。两种单色仪各有利弊,用石英玻璃做成的单色仪,在紫外光区有较高的色散率,波长精度较高,分辨率可达0.2nm,但在可见光区要大于2nm,波长精度不线性,像751G型分光光度计,是由光栅做成的单色仪,在全段波长(200nm～800nm)之间具有相同的波长精度。但目前大部分光栅或分光光度计所用的光栅都是复制光栅,波长精度不太高,如754、722、752型分光光度计,波长精度在±2nm。如制药厂采用定波长测量,需要强吸收峰,这时就要采用波长精度较高的仪器,否则很难测准最大吸收值,所以仪器的选用要根据工作要求。 近几年出现了不少带单片机的分光光度计,数据处理和操作功能大大加强,但基本原理没有变。二 日常维护做好仪器的日常维护保养工作,也是用好一台仪器的关键。分光光度计是一种高阻仪器,所以怕潮湿,过高的空气湿度将影响仪器的稳定性和电安全性,环境湿度一般控制在<85%。温度对仪器也有一定影响,因仪器灯源本身具有热量。当工作一段时间后,仪器本身温度会增加,当环境温度过高时会严重影响仪器读数的稳定性和使用寿命。实验室的温度一般控制在10℃～25℃之间。在日常维护工作中要定期更换仪器的硅胶,定期开机,这样才能保证仪器的正常使用和测量数据稳定可靠。三 比色器的选用分光光度计的比色皿若选用不当也会给分析工作带来较大误差。一般紫外光区用石英比色皿,可见光区用玻璃比色皿。石英比色皿可用在全波段,玻璃比色皿只能用于340nm以上波长,因为玻璃不透紫外光。使用中的比色皿会受污染,其配套性会变差。所以当发现配套性变差后要及时清洗,污染严重的要用重铬酸钾洗液清洗。当两个比色皿在检定配套性时其透射比之差小于0.5%透过率时,就要考虑重新配套或更换比色皿。另外,每次装入比色皿的溶液不要过满,一般装2/3即可,并在每次倒溶液时应小心操作,减少对进光面的擦洗次数,以防进光面磨损而影响透过率。分光光度计是计量仪器,必须定期检定或校准,若经修理后必须重新检定,经检定合格后方可使用。 狭缝是指由一对隔板在光通路上形成的缝隙，用来调节入射单色光的纯度和强度，也直接影响分辩力。 出射狭缝的宽度通常有两种表示方法：一为狭缝的实际宽度，以毫米（mm）表示，另一种为光谱频带宽度，即指由出射狭缝射出光束的光谱宽度，以毫微米nm表示。例如，出射狭缝的宽度是6nm，并不是说出射狭缝的宽度是6nm，而是指由此狭缝射出的光具有6nm的光谱带宽。 纯粹的单色光只是一种理想情况，分光光度计所能得到的“单色光”，实际上只是具有一定波长范围的谱带，狭缝越宽，所包括的波长范围也愈宽。 对单色光纯度来说，狭缝是愈窄愈好，但光的强度也就越弱，因此狭缝不能无限制地小，狭缝的最小宽度取决于检测器能准确地进行测量的最小光能量。目前达到的最小宽度为0.1nm。