pcr猪口蹄疫病毒试剂盒/英文名FMDA

【试剂盒简介】 口蹄疫病毒（FMDV）RT-PCR 检测试剂盒，采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR ）技术检测疑似感染动物的水疱皮或水疱液中所有血清型的FMDV，适用于FMDV的检测、诊断和流行病学调查。 【试剂盒原理】 利用吸附柱提取RNA作为模板，在反转录酶的作用下，以引物为起点合成与RNA 模板互补的cDNA链；然后在DNA 聚合酶的作用下，经高温变性、低温退火和中温延伸的多次循环，使特异DNA 片段的拷贝数放大数百万倍。将扩增的DNA 片段进行电泳、染色后，在紫外灯下，肉眼可见DNA 片段的扩增带。 【试剂盒组份】 大盒 （室温保存） 1. 裂解液 8mL 5. 洗脱液 500μL 2. BME 85μL 6. 阴性对照 350μL 3. 异丙醇 8mL 8. 吸附柱和收集管 12套 4. 洗涤液 15mL 9. 0.2 mL 薄壁PCR 管 15个 小盒 （-20℃保存） 7. 阳性对照 350μL 10. RT-PCR 反应液A 200μL 11. RT-PCR 反应液B 15μL 12．阳性模板添加液 5μL 【试剂盒保存条件及有效期】 1. 大盒请保存于室温，小盒请保存于-20℃。 2. 有效期为半年。 【需自备的材料】 生理盐水、组织研磨器、眼科剪、眼科镊、一次性注射器、经焦碳酸二乙酯（DEPC ）处理的灭菌1.5mL 离心管和吸头、琼脂糖、TAE电泳液、染色液。 【注意事项】 1．各试剂请在规定的温度储存。 2．本试剂盒有效期为6个月，不要使用超过有效期的试剂。 3. 反复冻融试剂将降低检测的灵敏度，建议3次内用完。 4．请严格按试剂盒说明书操作，移液、定时等全部过程必须精确。 5. 保存于-20℃的试剂使用前请完全融化，并瞬离15s，使液体全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液体时移液器吸头尽量在液体表面层吸取，使用后立即放回-20℃。 6．注意防止试剂盒组分受污染，试剂盒之间的组分不要混用。 7．RNA提取过程中，请戴口罩、勤换手套，尽量缩短操作时间。 【操作方法】 一、样品制备 1 样品采集：病死或扑杀的偶蹄动物，取溃烂或溃疡的表皮组织等；待检的活动物，取水疱皮或水疱液置于50%甘油生理盐水中，2～8 ℃保存。（要求送检病料新鲜，严禁反复冻融。） 2 样品处理： 2.1 组织样品的处理：每份组织分别从三个不同的位置称取样品约1g，用手术剪剪碎混匀后取0.1g于研磨器中磨碎，再加1mL生理盐水继续磨至无块状物；然后将样品转至1.5 mL灭菌离心管中，8000 rpm离心2 min，取200 μL上清于1.5 mL 灭菌离心管中。 2.2 水疱液的处理：取200 μL于1.5 mL 灭菌离心管中。 2.3 阳性对照的处理：混匀后，取100 μL于1.5 mL 灭菌离心管中。 2.4 阴性对照的处理：混匀后，取100 μL于1.5 mL 灭菌离心管中。 二、病毒RNA的提取 1. 往裂解液中加入77.6μL BME，充分混匀。（加入了BME的裂解液请放4℃保存） 2. 取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入600μL裂解液，充分颠倒混匀，室温静置10min 。 3. 加入600μL异丙醇，颠倒混匀。 4. 吸取650μL混合液转入吸附柱中，12,000 rpm 离心45s，弃去收集管中液体，套回收集管。 5. 重复步骤4。 6. 向吸附柱中加入600μL洗涤液，12,000 rpm 离心45s，弃去收集管中液体，套回收集管。 7. 重复步骤6。 8. 空柱12,000 rpm 离心2 min。 9. 将吸附柱移入新的无RNA酶的1.5 mL离心管中，在膜中央加入25μL洗脱液，室温静置1min，12,000 rpm 离心45s，获得总RNA。 三、RT-PCR 1. 反应体系配制：每份总体积20 μL，分别取16.8μL RT-PCR反应液A（用前混匀）、1.2μL RT-PCR反应液B和2μL模板RNA（阳性对照管加入1μL阳性对照RNA和1μL阳性模板添加液），混匀。 2. 反应程序：在PCR仪上运行以下程序：42 ℃ 45 min，95 ℃ 3 min ；95 ℃ 15 s 、60℃ 30 s ，35个循环；60℃延伸3 min。 四、电泳 1. 配制2 %琼脂糖凝胶。（请自备TAE电泳液、琼脂糖和染色液。） 2. 取10μL PCR产物点样于凝胶孔中，以5V/cm的电压进行电泳。 3. 当溴酚兰电泳至凝胶中下部时结束电泳，在紫外灯下观察结果。 【结果判断】 阳性对照出现131bp扩增带，阴性对照无带出现（引物带除外）时，实验结果成立。被检样品出现131bp扩增带为口蹄疫病毒阳性，否则为阴性。