人热休克蛋白60(Hsp-60)ELISA试剂盒使用说明书

人热休克蛋白60(Hsp-60)ELISA试剂盒使用说明书

本试剂盒仅供研究使用

预期应用

ELISA法定量测定人血清、血浆、细胞培养物上清或其它相关液体中人热休克蛋白60（Hsp60）含量。

实验原理

热休克蛋白60（HSP60）是一类进化上高度保守的蛋白质家族。生理状态时协助多肽或蛋白质的正确转位、折叠和装配,，起“分子伴侣”的作用；在应激状态下，HSP60过表达或异位表达,作为一种自身抗原被免疫系统识别，诱发机体的保护性免疫应答，也可作为一种信号分子，在信号转导中发挥作用.近年来研究证实HSP60在自身免疫性疾病、传染病、动脉粥样硬化及慢性感染的发病中均发挥重要的作用。

本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中HSP60水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入HSP60抗原、生物素化的抗人HSP60抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的HSP60呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。 

试剂盒组成及试剂配制 

1. 酶联板：一块（96孔） 

2. 标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为10000 pg/mL，做系列倍比稀释后，分别稀释成10000 pg/mL，5000 pg/mL ，2500 pg/mL，1250 pg/mL，625 pg/mL，312 pg/mL，156 pg/mL，其原液直接作为最高标准浓度，样品稀释液直接作为标准浓度0 pg/mL，临用前15分钟内配制。

如配制5000 pg/mL标准品：取0.5ml 10000 pg/mL的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。

3. 样品稀释液：1×20ml/瓶。

4. 检测稀释液A：1×10ml/瓶。

5. 检测稀释液B：1×10ml/瓶。

6. 检测溶液A：1×120ul/瓶（1：100）临用前以检测稀释液A 1：100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100ul），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。

7. 检测溶液B：1×120ul/瓶（1：100）临用前以检测稀释液B1：100稀释。稀释方法同检测溶液A。

8. 底物溶液：1×10ml/瓶。 

9. 浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 

10. 终止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。 

标本的采集及保存 

1．细胞培养物上清：请离心后收集上清，并将标本保存于-20℃，且应避免反复冻融。

2．血清：标本请于室温放置2小时或4℃过一晚后于1000 x g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。

3．血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8° C 1000 x g离心15分钟，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。

注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

操作步骤

各试剂在使用前平衡至室温。

1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。除空白孔外，余孔分别加标准溶液或待测样品100ul，注意不要有气泡，轻轻混匀，酶标板加上盖，37℃反应120分钟。

2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。

3. 每孔加检测溶液A工作液 100ul，37℃,60分钟。洗板3次，350ul/每孔，甩干。 

4. 每孔加检测溶液B工作液 100ul，37℃，60分钟，洗板5次，甩干。

5. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色30分钟（此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显）。

6. 依序每孔加终止溶液50ul，终止反应（此时兰色立转黄色）。用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。 

注：

1． 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是最后加底物溶液及2NH2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。 

2．为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

特异性

    本试剂盒可同时检测重组或天然的人HSP60，且与其它相关蛋白无交叉反应。

计算

  以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。 

注意事项

1． 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。

2． 一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

3． 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。

4． 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。

5．在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。

6．底物请避光保存。

检测范围：

156 pg/mL -10000 pg/mL

说明 

1．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。

2．有效期：6个月

3．浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。 

4．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。 

5．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。

厦门慧嘉生物科技有限公司专业代理众多国际生命科学领域的知名品牌。致力于各种ELISA试剂盒、免疫组化试剂盒、一抗二抗、细胞因子、生物试剂、移液器、耗材的销售推广及服务工作。
咨询电话：0592-6020891  18906011628    http://www.biohj.com