ELISA试验条件的选择

1．固相载体的选择 载体的种类很多，其中包括纤维素、交联右旋糖酐、葡萄球菌聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。从使用形式上可有凹孔平板、试管、珠粒等。 聚苯乙烯凹孔板是应用最广泛的一种载体。聚苯乙烯塑料微量滴定板吸附蛋白的性能好，操作简便、用量小，适于大批检查。 由于聚苯乙烯的工艺过程不够稳定,造成各批次差异较大。所以进行ELISA之前，必须进行筛选。检查方法： ⑴ 吸附性能的检查：先加抗体包被，然后加入同一稀释度的酶标抗体，最后加底物、显色、测OD值,求出总平均OD值,再求出每相邻两孔的OD平均值,此均值在总均值的±10%以内为合格,若中间孔与四周孔OD值相差太大，或一侧与另一侧孔OD值相差较大均属不合格。 ⑵ 对比测定阳性血清与阴性血清，观察是否存在明显差异，若二者OD值相差于10倍以上者为合格。 板的处理。新板一般不用处理,用蒸馏水冲洗即可应用。板用一次即废。但不少实验工作者认为用超声波处理，清洁液Tritonx100、20%乙二醇处理仍可应用。但发现空白对照显色较深和阳性样品显色结果不理想时，应弃去不用。 2．载体的吸附条件 载体的吸附均为物理吸附。吸附的多少取决于PH值、温度、蛋白浓度、离子强度以及吸附时间等。 较好的吸附条件是：离子强度为0.05Mol/L～0.10Mol/L，pH9.0～pH9.6碳酸盐缓冲液，蛋白浓度为1µg/ml~100µg/ml，4℃过夜或37℃3h。 3．酶标抗体使用浓度的确定 于聚苯乙烯板孔中加足够量的抗体包被,温育一定时间，冲洗、把酶标结合物倍比稀释，每个稀释度加2孔,温育、冲洗、再加底物显色、比色。以OD值为纵坐标,酶标结合物的稀释度为横坐标，制作曲线。找出OD值为1时，相对应的酶标抗体稀释度为最适酶标抗体稀释度。 这个稀释度是指在这种条件下的最适稀释度，换个条件就不是最适的了。如1﹕400的酶标抗体稀释度温育6h可与1︰6 400稀释度温育24h结果相同。所以一旦条件确定之后，就不要变更，以保证结果的重复性和相对的准确性。 此最适酶标抗体稀释度可做为工作浓度，也可提高半个至一个滴度，但不能提高过高，否则非特异性显色增加。 酶标抗体的滴度反映酶标抗体的质量，也可以此比较酶标结合物的优劣。有材料报道认为1︰320滴度为合格,1︰1 000以上更好。酶标抗体滴度越高，用于工作浓度的稀释倍数就越大，敏感性就越高，非特异性反应就越低。 4．抗原： ⑴ 抗原的要求： 用于ELISA的抗原必须采用相当纯的抗原，如果含有其它杂质，将与抗原共同竞争固相载体上的有限位置。用于其它血清学反应的抗原不一定能适用ELISA实验，必须经过试验，抗原必须能牢固地吸附于载体上，而不丧失其免疫活性，且可得到有规律的重复的结果。另外在吸附载体后，对加入的各种试剂产生最小的非特异性吸附，即与阴、阳性血清结合差异较大。 ⑵ 抗原效价的测定 可采用单方阵或双方阵试验。①单方阵试验：以不同稀释度的抗原包被酶标板，以常规的1﹕200倍稀释的阳性血清加入，再加入酶标抗体、显色、测OD值，以OD值为1.0时，相应的抗原浓度作为使用效价；②双方阵试验比较精确，它既能测出抗原的最适浓度又能测出抗体的最适浓度。即将抗原抗体均稀释成不同浓度进行酶标抗体反应，以血清稀释倍数最高的阴、阳性血清的光吸收值差最大的所对应的抗原稀释度为抗原的使用效价。 已吸附的抗原的固相载体经冻干或干燥保存很稳定,数月仍不失活。 5．抗体 抗体效价的测定同抗原,采用双方阵试验。 6．清洗液 一般采用0.01Mol/L pH 7.2 PBS吐温缓冲液。吐温是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，为非离子型的表面张力物质,常做助溶剂。吐温的编号依聚合山梨醇所结合的脂肪酸种类不同而定。吐温20是结合月桂酸、吐温40是结合棕榈酸、吐温60是结合硬脂酸,吐温80是结合油酸等。通常用吐温20加入缓冲液内做为湿润剂,以减少非特异性吸附。也可在PBS缓冲液中加入1%牛血清白蛋白(或10%小牛血清或卵清蛋白),特别在抗原包被以后,以牛血清白蛋白缓冲液再包被一次,而占据孔内剩下位置,这样来减少非特异性反应。 7．反应时间 抗原与抗体、抗体与酶标抗体反应一般在37℃ 2h～3h达到高峰。时间太短,敏感性下降,时间太长,吸附的抗原或复合物(在这个温度下)可能脱落。 酶底物反应时间的确定：一般采用15min～30min～45min。也可以标准阳性血清为准,随时测定其OD值,当达到规定的OD值时,即终止反应。