Beta Agonists(β-兴奋剂)ELISA Kit

英国RANDOX的ELISE试剂盒在检测药物残留时具有易于使用，不需要昂贵设备等特色，同时该 ELISE 试剂盒显
示出与 GC-MS 良好的相关性。同传统的方法（如纸片法、 TTC 法等为主的 MIT 法）相比较，具有 5-10 倍的灵敏，
易于使用，较低的设备费用，快速 2-3 小时内分析的样品多达百个，而使用 GC-MS 处理单个样品就需要 30min。 

β-兴奋剂酶联免疫检测试剂盒
（产品编号：SU2148）
使用说明书
一、 试剂盒简介
本试剂盒适用于组织、饲料及尿样内所含β-兴奋剂族的定量测试。试剂盒性能稳定，操作便捷，灵敏度高。
试剂盒包括以下内容：
中文名称 英文名称 规格
已包被抗体的酶标板（可拆式） Microtitre Plate 12×8孔
稀释剂/洗涤缓冲液（浓缩）（绿帽） DiLuent/Wash Buffer(Conc.) 1×32 mL
酶标记物抗原稀释剂（蓝帽） Conjugate Diluent 1×20 mL
酶标记抗体（浓缩） Conjugate(Conc.) 1瓶
单组分底物/发色剂（棕色瓶） One Shot Substrate 1×15 mL
标准液（黑色帽） Standards 6×2 mL
反应终止液（蓝色帽塑料瓶） Stop Solution 1×15 mL
注：所有浓缩液均需稀释后使用，稀释方法见试剂制备及使用

检测下限
β-兴奋剂族 尿 组织 饲料
克伦特罗 0.1 ng/mL 0.2 ng/g 1.1 ng/g
卡布特罗 1.1 ng/mL 0.6 ng/g ——
沙丁胺醇 0.2 ng/mL 0.3 ng/g 2.0 ng/g
甲基克伦特罗 1.3 ng/mL 0.7 ng/g ——
溴布特罗 2.0 ng/mL 1.0 ng/g ——
特布它林 2.0 ng/mL 1.0 ng/g ——
马布特罗 2.2 ng/mL 1.1 ng/g ——
吡布特罗 3.2 ng/mL 1.6 ng/g ——
吗喷特罗 4.0 ng/mL 2.0 ng/g ——
西马特罗 10.0 ng/mL 5.0 ng/g ——
二、 SU2148 β-兴奋剂试剂盒原理
1、 在可拆解成条状的酶标板上，已包被了β-兴奋剂族特异性抗原。
2、 标准液或样品中的β-兴奋剂族会和酶标记物争夺酶标板上抗体的结合位点，形成抗体/抗原复合物或抗体/酶标抗原复合物。
3、 洗涤酶标板，除去游离的酶标记物。加上底物/发色剂。在一定的温度范围内，抗体/酶标抗原复合物催化底物/发色剂发生显色（蓝色）反应。加入酸后，反应终止，同时反应物的颜色由蓝色转为黄色。
4、 颜色的深度与β-兴奋剂族含量成反比。在450纳米（nm）波长的酶标仪上，可读出相应的吸光度值。
三、 样品制备
（一） 尿液样品制备
尿样不用处理，清亮尿样直接测定（如果尿样有比较严重的浑浊，要过滤或离心直至得到清亮尿样）
（二） 组织样品制备（肝、肾、肌肉、视网膜）
所需要的试剂：
500mmol/L盐酸：一般购买的盐酸为10mol/L,所以用蒸馏水按体积比1（浓盐酸）：199（蒸馏水）进行稀释即可
500mmol/L磷酸二氢钾缓冲液：例如用6.8g磷酸二氢钾固体溶于100mL蒸馏水中，再用强酸调PH值到3.0
50mmol/L磷酸二氢钾缓冲液：用500mmol/L磷酸二氢钾缓冲液稀释十倍，再检查PH值是否为3.0
1 mol/L氢氧化钠：例如用4.0g氢氧化钠 溶于100mL蒸馏水
甲醇（100%）：一般市场上购买的产品达到分析纯即可
所需要的仪器：
冷冻离心机：要有50mL的离心管和相应的转子
均质机：要求转数在4000转以上
样品前处理步骤：
（1） 5g粉碎的样品与25mL 50mmol/L HCL混合，振荡1.5小时，以达到均质的目的。
（2） 称6g均质物（相当于1g肝脏），加入离心瓶中。
（3） 离心15分钟/4000g或更高的转速，在10-15℃（50-59℉）.
（4） 转移上清液到另一个离心瓶中，加300uL 1 mol/L氢氧化钠混合15分钟。
（5） 加入4mL 500mmol/L磷酸二氢钾缓冲液PH 3.0,简单的混合并在4℃保存至少1.5小时或过夜。
（6） 离心15分钟/4000g或更高的转速，在10-15℃（50-59℉），分离全部上清液（应该是清亮的，非常重要），使其升至室温（20-25℃），然后用以下方法进行C-18柱纯化。
C-18柱纯化方法：
（1） 用3mL甲醇（100%）洗涤柱子，流速为1滴/秒
（2） 用2 mL 50mmol/L磷酸二氢钾缓冲液洗涤液过柱，流速为1滴/秒
（3） 样品进柱（肝，肉，或组织的全部上清液），流速为1滴/4秒
（4） 用2 mL 50mmol/L磷酸二氢钾缓冲液洗涤液过柱，流速为1滴/秒
（5） 用正压去除残留的流体并且用空气或氮气吹2分钟干燥柱子
（6） 用1mL甲醇（100%）洗脱样品，流速为1滴/4秒
（7） 在50-60℃并且在弱空气或氮气流下完全蒸发甲醇
（8） 用1mL蒸馏水溶解干燥的残留物进行分析
注意：
A) 所有试剂和样品处理必须在室温条件下（20-25℃）并严格控制过柱时的流速
B) 在第（7）步中如果很难蒸发干甲醇，说明含有一定水分，原因主要出在第（5）步中没有吹干柱子或甲醇本身有质量问题
C) 最后处理完的样品可能有黄色，属于正常现象，不影响以后的实验
D) 未处理的样品冷冻保存
E) HCL均质后的样品在2-8℃稳定3天
F) 以磷酸二氢钾缓冲液提取后的样品（C18柱纯化之前）在2-8℃稳定2天，使用前离心
G) C-18柱纯化步骤6所获得的甲醇洗脱物可以冷冻保存数周，在2-8℃稳定2周
视网膜样品应该采用以下方法快速抽提：
1） 称取0.1g视网膜，加入贴有标签的聚苯乙烯容器中或玻璃试管中。
2） 加入1.25ml用双蒸馏水配制的0.1%十二烷基磺酸钠溶液。
3） 涡旋振荡至少30分钟。
4） 加入5ml叔丁基亚甲基醚（TBME）和100µl饱和氯化钠溶液。
5） 涡旋振荡3分钟。
6） 2000rpm离心分离10分钟。
7） 在TBME层移取4ml样到干净的玻璃试管中，50℃温度下，用空气流蒸发干燥。
8） 用0.25ml已稀释的ELISA稀释剂/洗涤缓冲剂，复溶干燥物，涡旋振荡3分钟。制备好样品可用于ELISA检测。
（三）饲料样品制备
1、 用研钵将饲料样品研碎。
2、 称取2.0克研碎的饲料。
3、 加入2.0ml 1M盐酸。
4、 加入18ml双蒸馏水。
5、 均匀混合。
6、 涡旋振荡3分钟。
7、 将样品放入振荡器中振荡15分钟。
8、 2000rpm离心20分钟。
9、 将上清液缓缓移入另外的容器，再向上清液中加入1.0ml 1M氢氧化钠溶液。
10、确保PH值在7-9。
11、2000rpm离心20分钟。
12、样品便可用于ELISA检测。
四、试剂准备及其稳定性
（一） 酶标板（12×8孔 可拆式）
可以直接使用。在2℃至8℃储存下，可保持稳定至有效日期。如只使用部分酶标板，把余下的放回原来的锡袋中，尽量挤出空气后重新密封。
（二） 稀释剂/洗涤缓冲剂（浓缩）
用970ml的双蒸馏水（Double Distilled H2O）,把稀释剂/洗涤缓冲剂稀释。储存在2℃至8℃下，可保持稳定至30天。
（三） 酶标记物稀释剂
储存在2℃至8℃下，可保持稳定性至有效期。
（四） 酶标记抗原（浓缩）
本试剂盒提供浓缩酶标记物，稀释方法见附录。
（五） 单组分底物/发色剂
提供备用，储存在2℃至8℃下，可保持稳定性至有效期。不含有害有机化学溶剂，避免酶标记抗原接触光线。
（六） 标准液
提供备用，储存在2℃至8℃下，可保持稳定性至有效期。（见英文说明BETA-AGONIST STANDARDS中Concentration项下所示浓度）
（七） 反应终止液
提供备用，储存在2℃至8℃下，可保持稳定性至有效期。
（八） 需要自备的器材
ELISA检测用：
酶标仪（450nm波长）
洗板机
可调移液枪（10 µL-125 µL）
酶标板密封胶带
硫酸（0.2 M）
五、 检测步骤
待所有试剂的温度回复至室温（约19℃至25℃）方可使用。为了减低边缘效应，建议在反应过程中用酶标板密封胶片将酶标板密封。
每个标准、质控或样品要做两份平行试验，并做好加样位置的记录。
注：如果试验条件不允许，可以不做质控。
（一）组织/尿液/饲料测试
1、用移液枪吸取标准或样品50µl，分别加入到指定的微孔中，然后加入100µl酶标记物到每一个微孔中，用酶标板密封胶纸把酶标板盖住。
2、左右轻敲酶标板边缘数秒，将其置于室温下（19℃～25℃）培养1小时。
3、翻转酶标板，使孔内所有液体倾出。
4、吸取已稀释的洗涤缓冲液250-300µl洗涤酶标板4次，此过程需10-15分钟，每次洗涤时，将所有液体轻轻倒出，拍干。
5、立刻用8通道移液管移取125µl单组分底物/发色剂到每一孔里。完毕后，左右轻敲酶标板，将其放在避光的恒温箱内（约20℃至25℃）20±2分钟。
6、加入100µl 0.2M硫酸终止反应，反应物的颜色会由蓝色转为黄色。
7、于10分钟内，用450nm的酶标仪测定吸光度值。
（二）标准曲线及结果分析
1、分别计算标准、质控和样品的平均吸光度。
2、以吸光度值为纵坐标，标准浓度的对数值为横坐标建立标准曲线。
3、从标准曲线上读取质控和样品的吸光度值。
4、结果的计算和单位的转换
尿液样品和组织样品：计算出的结果既为实际结果。
视网膜样品（快速提取法）：将结果乘以3.1便可。
饲料样品：将结果乘以11便可。
（三）如呈阳性反应，应该从其它方法得以证实（例如色谱/质谱分析）。
六、试剂盒的技术参数
特异性
与β-兴奋剂抗血清交叉反应的化合物如图表：
成份 Compound % Cross-Reactivity
克伦特罗 Clenbuterol 100
卡布特罗 Carbuterol 90
沙丁胺醇 Salbutamol 86
甲基-克伦特罗 Methyl-Clenbuterol 75
溴布特罗 Brombuterol 53
特布它林 Terbutaline 50
马布特罗 Mabuterol 45
吡布特罗 Pirbuterol 25
吗喷特罗 Mapenterol 32
西马特罗 Cimaterol 10
莱克多巴胺 Ractopamine ＜0.2
非诺特罗 Fenoterol ＜0.2
注意事项：
1、 稀释/洗涤缓冲剂含有防腐剂，避免进食及与皮肤或粘膜接触。
2、 如有需要，可提供健康与安全数据表（MSDS）
中文译件仅供参考，以试剂盒内附的英文原件为准
附录
酶标记抗原的稀释方法
稀释比例为1：360，参考方法如下：
步骤一：去20µl酶标记抗原浓缩液加入0.8mL酶标记物抗原稀释剂。
步骤二：去500µl酶标记抗原浓缩液加入4mL酶标记物抗原稀释剂。
此稀释后的液体量足够4条使用
注意：
1. 稀释后的液体应立即使用。
2. 每一步稀释的液体应混合均匀。否则浓度过高会造成结果吸光度过高。
可以根据具体试验情况按照比例自行稀释。