高效液相色谱法测定饲料中叶酸的含量

　　饲料是所有人饲养的动物的食物的总称，比较狭义地一般饲料主要指的是农业或牧业饲养的动物的食物。包括大豆、豆粕、玉米、鱼粉、氨基酸、杂粕、添加剂、乳清粉、油脂、肉骨粉、谷物、甜高粱等十余个品种的饲料原料。按原料不同，可分为粗饲料、青绿饲料、青贮饲料、能量饲料、蛋白质补充料、矿物质饲料、维生素饲料、添加剂等。

　　叶酸也叫维生素B9，是一种水溶性维生素。《饲料添加剂 叶酸(GB/T 7302-2008)》规定了饲料添加剂叶酸的要求、试验方法、检验规则及标签、包装、运输、贮存等。适用于化学合成法制得的叶酸产品，在饲料工业中作为维生素类饲料添加剂。实验用碳酸钠溶液提取饲料中的叶酸，提取液经阴离子交换固定萃取小柱净化富集后，注入反相高效液相色谱仪反相色谱系统中进行分离，用紫外检测器检测。

　　实验仪器

　　高效液相色谱仪（南京科捷分析仪器有限公司），紫外检测器（或二极管阵列紫外可见光检测器），离心机，固相萃取装置等。

　　样品准备：

　　1.提取 准确称取试样适量，配合饲料及浓缩饲料2.5 g，添加剂预混合饲料1 g，至50 mL离心管中，加入5 mL（预混合饲料8 mL）0.1mol/L EDTA溶液，涡旋混合2min，加入25mL甲醇，涡旋混合2min，全部移至50mL容量瓶中，再加入10mL 1mol/L碳酸钠溶液，用水定容至50mL，超声提取15min后，取20mL样液于50mL离心管中，10000rpm离心10min。准确移取上清液10mL，于15mL离心管中，在40℃下氮吹至约6.5mL。

　　2.净化 固相萃取柱先用5mL甲醇活化，再用5mL水进行平衡后，移取全部6.5mL备用液过柱。取5mL水冲洗盛放上清液的离心管，充分转移至萃取柱中淋洗，再用5mL甲醇淋洗，抽干5min，用6mL洗脱液每次2mL分3次洗脱，流速控制在1ml/min，收集洗脱液。洗脱液在40℃下氮吹至1.0mL以下，向残余物中加水至1.0mL，超声2min，混匀后过0.22μm滤膜，进样检测。

　　色谱条件（参考）：