液相色谱法检测血浆中牛磺酸的浓度

   牛磺酸是存在于动物以及人体内的非蛋白质游离氨基酸，它具有消炎、镇痛、解热、镇静、保护心肌、抗脑缺血及增强免疫力等作用，是人类必需氨基酸。

   牛磺酸的含量检测方法较多，目前常用的方法有酸碱滴定法、分光光度法、气相色谱法、氨基酸自动分析法、荧光法及高效液相色谱法（HPLC）等。

   牛磺酸的HPLC法测定本用柱前或柱后衍生的方法，衍生试剂为2，4－二硝基氟苯（DNFB）、邻苯二甲醛（OPA）、异硫氰酸苯酯（PITC）及9－氯甲酸芴甲酯（FMOC）等。

   这里介绍用DNFB柱前衍生化法和梯度洗脱的方式分离各成分，建立人血浆中牛磺酸的定量测定方法。

   方法仪器：高效液相色谱仪。 

   色谱条件：C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相A为0.05mol/L乙酸钠溶液（pH6.5），流动相B为乙腈－水（1∶1），梯度洗脱，流速为1mL/min，柱温30℃，检测波长360nm，进样量20μL。

   溶液配制

   流动相A：取无水乙酸钠4.1g，加水至1000mL，加乙酸10μL，配至浓度为0.05mol/L，pH为7.0；流动相B为乙腈－水（1∶1），超声除气；

   磷酸盐缓冲溶液（pH7.0）：取磷酸二氢钾6.8g，加0.1mol/L的氢氧化钠291mL，加水至1000mL，pH为7.0；

   牛磺酸储备液：取牛磺酸20mg，加水定容至10mL，质量浓度为2mg/ml；

   DNFB衍生试剂：取DNFB250μL，加乙腈至25mL，浓度为1%；碳酸氢钠溶液：碳酸氢钠21g，加水至500mL，浓度为0.5mol/l。其中，流动相A、流动相B、磷酸盐缓冲溶液和碳酸氢钠溶液均经0.45μm滤膜滤过。

   测定：取人血浆样品500μL和乙腈500μL混匀10s，以4000r/min离心5min。取上清液600μL至5mL容量瓶中，加入碳酸氢钠600μL及DNFB375μL后，在60℃避光条件下水浴1h。取出后，加缓冲液至5mL容量瓶刻度，微孔滤膜滤过。取上清液20μL进样测定。