高效液相色谱法的实验技术

【南京科捷】当使用液相色谱仪进行高效液相色谱分析时，除了解高效液相色谱法的基本理论外，还应掌握必需的实验技术，这样才能获得理想的分离效果。
在高效液相色谱分析中，当色谱柱的选择确定后，应采用适合组成的流动相进行实验，在实验过程准确控制流动相的流量，防止微米数量级机械杂质阻塞流路，保持较低的柱压力降是实验操作中的关键。为此，色谱工作者应当掌握以下的实验技术：

• 溶剂的纯化技术。

在高效液相色谱分析中，正相色谱以己烷作为流动相主体，二氯甲烷、氯仿、乙醚作为改性剂；反相色谱以水作为流动相主体，以甲醇、乙腈、四氢呋喃作为改性剂。通常使用分析纯、优级纯试剂，可以满足高效液相色谱分析的要求，但为了防止微粒杂质堵塞流路或柱入口垫片，流动相都需要用G4微孔玻璃漏斗过滤，或用0.45μm的微孔滤膜过滤后再使用。

• 色谱柱的填充技术。

填充色谱柱的方法，根据固定相微粒的大小有干法和湿法两种。微粒大于20μm的可用干法填充，要边填充边敲打和振动，要填得均匀扎实。直径10μm以下的柱，不能用干法填充，必须采用湿法。

• 色谱柱的保护与再生技术。

高效液相色谱柱填充了高效全多孔球形微粒固定相，并用高压匀浆法填充，其售价较贵，若使用不当，会出现柱理论塔板数下降、色谱峰形变坏、柱压力降增大、保留时间改变等不良现象，从而大大缩短色谱柱的使用寿命。

• 梯度洗脱技术。

在HPLC分析中，梯度洗脱功能相似于气相色谱分析中的程序升温，它对改善色谱分离效果，增加峰容量，可发挥重要的作用。

• 色谱柱前和柱后的衍生化检测技术。

当前在高效液相色谱法，最常用的高灵敏度检测器是荧光检测器和紫外检测器，但它们只能检测有紫外吸收或在紫外光照射下产生荧光的、具有特定化学结构的化合物。
为了使在这些检测器上响应值很小的化合物也能被检测出来，通过与衍生化试剂反应，使胺、氨基酸、羧酸、醇、醛、酮等有机物生成可吸收紫外光或产生荧光的化合物。

• 样品的预处理技术。

对组成复杂的样品或受外界条件（日光照射、受热、电磁辐射、氧化等）作用而发生变化的不稳定样品，都需经过预处理才能进行色谱分析。
    掌握上述各种技术，就可更自主的开展工作，并为进一步从事微柱液相色谱分析或二维液相色谱分析创造良好的前提工作条件。
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