叶绿素的荧光光谱测量

实验背景：「叶绿素」的光学知识

       叶绿素是植物从光中吸收能量所需的基本色素。它在可见光谱的蓝色和红色部分吸收光较强，在可见光谱的绿色部分吸收光较弱，这使它在人的肉眼中成为可识别的绿色。

       叶绿素的检测可以追溯到19世纪早期，1817年Joseph Caventou和Pierre Pelletier将其分离出来。后来，利用了立体化学、核磁共振、光学和质谱等方法检测了分子的元素组成和一般结构。

要确定叶绿素浓度，其中一种方法就是测量其荧光发射率。叶绿素在650-800 nm范围内可以检测到荧光，再通过测量700 nm和735 nm左右波长的荧光发射峰值，计算它们的比值，可以推导出叶绿素含量的线性关系。

叶绿素的存在是植物呈现绿色的原因，而缺乏叶绿素会导致叶子的颜色变成红色或黄色。基于这一点，我们使荧光发射峰值更高，从而得到叶绿素浓度更高的绿色一品红叶。

本实验将过比较不同颜色一品红(红、绿、白)叶片的荧光光谱，测定其叶绿素浓度。

图1 用于实验的一品红植物

溶解在甲醇中的红色叶片样本(左)，绿色叶片样本(中)和白色叶片样本(右) 

此外，我们还将测量一个白色一品红片样本，对比其与红色和绿色叶子样本的叶绿素浓度。测量时，每一片叶子都被溶解在甲醇中，以便从每个样品中分离并提取叶绿素(图1)。

实验系统：

本实验的系统如图所示(图2)。光谱仪使用的是AvaSpec-ULS2048CL-EVO，该设备拥有新的光谱学技术。这款光谱仪提供USB3.0通信，速度是USB2.0的10倍，使用了CMOS探测器，AS-7010电路板，这款电路板上可以存储更多的光谱，实现更多功能。此外，这款光谱仪可以定制狭缝尺寸，光栅，光纤入口和连接器，以满足各类应用需求。

图2：叶绿素测量实验装置

其他用于实验的配件有单色仪, 用于过滤特定波长光源,以确保只有所需观察的发射光谱。比色皿支架(CUV-DA)，可以使样品暴露在较大的光量下。一个比色皿遮罩 (CUV-COVER-DA)，用来减少环境光的影响。600微米纤芯光纤(FC-UVIR600-1-BX)，用来连接光谱仪和比色皿。三个样品(红叶样品、绿叶样品和白叶样品)都放入比色皿中测量。

实验方法及数据：

每个叶片样本溶解在约30ml的甲醇中，将存有样本的溶液在120°C的加热板上加热1分钟来提取叶绿素，再将混合溶液移入比色皿中进行分析测量。将单色仪直连到AvaLight-Hal-S-Mini上，接着在不同波长之间循环测试，直到找到能使样品达到亮度较大的波长，此激发波长为620 nm处。

数据分析模块，我们使用了AvaSoft的Sd模式，AvaSoft是我们定制的软件包。Sd模式是测量荧光的常用模式。因为Sd模式从每个波长的原始计数(即范围模式)中减去暗背景光谱(光谱仪在没有光源的情况下测量的光谱)。这有助于减少光谱中的噪声，并更好地隔离发射峰。

调整积分时间可以增加或减少一次测量的光量，这会影响结果光谱的整体幅度大小。平均次数表明两个值被平均在一起，可以提供更一致的光谱结果。实验时，我们将积分时间设为9秒，平均值设为2。此外，我们用试管支架盖覆盖了所有样品，以确保测量的光来自光源，避免环境光的影响。

实验结果分析：

图3：红色一品红样品的荧光光谱

发射峰在673.90 nm和722.84 nm

图4：绿色一品红样品的荧光光谱

发射峰在687.17 nm和730.87 nm

图5：白色一品红样品的荧光光谱

发射峰在675.63 nm和726.28 nm

红色一品红叶片样品的荧光光谱测量到的发射峰在673.90 nm和722.84 nm(图3)。这符合与文献报道中所描述的的：叶绿素发射峰在650-800 nm之间。

绿色一品红叶片样品的荧光光谱在687.17 nm和730.87 nm处显示更高的发射峰(图4)。与红色叶片样品相比，这两个峰略高，但仍与文献报道所描述的叶绿素发射峰一致。

白色一品红叶片样品的荧光光谱(图5)与红色叶片样品具有相似的发射峰(675.63 nm和726.28 nm)，但每个发射峰的强度更大。

图6：三种样品的荧光光谱对比图

红色一品红样品(红色线)，绿色一品红样品(绿色线)，白色一品红样品(蓝色线)

图6为红色一品红样品(红色线)、绿色一品红样品(绿色线)和白色一品红样品(蓝色线)的荧光光谱比较。为了直接比较每个样品的叶绿素含量，计算735 nm和700nm峰值的比。红叶样本，两个峰的比值为7492.67/26998.33，等于0.278。对于绿叶样本，比值为44973.55/53473.00，即0.841。白叶样本的比值为13650.20/44659.54，即0.306。

综上所述，红叶和白叶样品相比，绿叶样品中的叶绿素浓度要高得多。此外，红叶和白叶样本的叶绿素浓度相似，尽管白叶样本比红叶样本看起来更绿。