动物活体成像 - 生物发光活体成像实验技巧

通过上期的介绍，我们已经知道，生物发光和荧光作为最常见两种光学成像技术，各有特点。其中生物发光技术因其背景噪音低，灵敏度高等优点，在肿瘤，分子互作及信号传导等研究中得到了广泛应用。当两种方法都适用于研究对象时，更推荐用生物发光标记方法开展成像实验。

一个完整的生物发光实验流程，至少应包括实验设计（选择合适的荧光素酶报告基因和荧光素底物）、细胞培养与转染（将荧光素酶报告基因转染至细胞中，使其表达荧光素酶）、动物模型准备（选择适当的动物模型，并根据需要进行基因编辑或诱导特定病理状态）、细胞注射或移植（将标记细胞注射或移植到动物模型中）、荧光素底物注射（在成像前向动物注射底物，可通过腹腔注射、静脉注射或口服等方式）、成像观察（使用高灵敏度的活体成像系统，在预定的时间点捕捉生物发光信号）等。

本期，我们将深入探讨生物发光活体成像系统的实验技巧，从荧光素的选择到实验结果的分析，逐一探讨生物发光实验的注意事项及技巧。

荧光素的选择

荧光素酶与荧光素的化学反应是生物发光的基础，选择合适的发光酶和底物是实验成功的第一步。生物发光活体成像系统常用的发光酶包括萤火虫萤光素酶、海肾萤光素酶等。实验一般选用萤火虫萤光素酶，有时也会用海肾萤光素酶。

二者区别如下表所示：

体外验证

将构建的细胞加入150μg/ml D-luciferin 底物溶液2分钟后使用IVScope小动物活体成像系统观测，然后进行生物发光的定量分析。

计算单个细胞单位时间发出的光子数，当数值大于100时，适合进行体内实验，数值过低或过高，都不适合体内成像或长期观测。将定量数据绘制标准曲线，计算标准差，线性好证明细胞表达稳定，线性差则表明荧光素酶表达不稳定，同样不适合进行体内实验。

细胞接种

确保细胞是在良好的生长状态下，并且已经稳定转染或转录了荧光素酶基因。在接种前，使用细胞计数器或自动细胞计数仪对细胞进行准确计数。接种部位和数量应根据实验需求进行调整，将细胞接种到实验动物体内。确保细胞在体内生长、扩散，以产生稳定的发光信号。

荧光素底物注射

将萤光素或其它底物注射入实验动物体内。实验总结出荧光素的合适的用量是150mg/kg，即体重20克的小鼠需要3毫克的荧光素。注射方式有静脉注射、腹腔注射、鼻吸（i.n.）或其他方式。

腹腔注射（i.p.）：腹腔注射扩散较慢，持续发光长。

静脉注射（i.v.）：血液运输，灵敏度高，重复性好。信号来的快，去的也快

鼻吸（i.n.）：适合于肺部成像

根据实验目的和动物模型的特点，选择合适的注射方式。注射时，需注意注射速度、剂量和浓度，以确保发光信号在体内均匀分布。

体内预实验确定最佳成像条件

在正式实验前，进行预实验以确定发光时间线和最佳拍摄时间。一般情况下，腹腔注射底物约一分钟后表达荧光素酶的细胞开始发光，十分钟后强度达到最高。在最高点持续约20-30分钟后开始衰落，约三小时后发光全部消失。所以合适的检测时间是在注射后15-35分钟内。

麻醉方法

为减少实验动物在成像过程中的运动干扰，需对其进行麻醉。选择合适的麻醉药物和剂量，确保动物在成像过程中处于稳定状态，保证获得的实验数据准确可靠，又能最大限度地保障动物福利，确保其安全。实验动物一般较难合作，因此实验中常采用全身麻醉，根据麻醉方式分为吸入麻醉和非吸入麻醉。

吸入麻醉与注射麻醉的区别如下表：

成像设备的选择

在生物发光实验中，合适的仪器对确保实验结果的准确性和可靠性至关重要。

理想的成像仪器应具备以下特点：

1. 高灵敏度 

选择具有高灵敏度的仪器，以便检测低水平的信号，这对于早期疾病检测和微小变化的监测至关重要。

2. 高分辨率

考虑仪器的动态范围和分辨率，高分辨率仪器能够提供更清晰的图像，有助于更精确地定位和量化生物学过程。

3. 宽动态范围

仪器应具有宽广的动态范围，能够同时检测到从低到高的信号强度。以保证在不同条件下都能获得清晰的信号和高质量的图像。仪器的背景噪声应尽可能低，以提高信噪比。

4. 操作便利性、环境适应性及样本兼容性

选择用户界面友好、易于操作的设备，且能够适应不同的实验条件和样本类型。考虑仪器与其他实验设备的兼容性，以及未来升级或添加新功能的潜力。

5. 良好的技术支持和服务

确保在遇到操作或技术问题时能够得到及时有效的帮助。综合这些因素，选择适合的生物发光实验仪器，将有助于提高实验的成功率和数据的质量。

实验结果判读和分析

获取高质量的成像数据只是研究的一部分，结果的判读与数据分析同样重要。它能帮助研究人员从图像中提取有价值的信息，并得出科学结论。

1. 图像优化处理：采用软件对拍摄到的图像进行优化处理、灰度调节、伪彩色处理等，以提高图像质量。

2. 定义感兴趣区域（ROI）：计算发光强度、发光面积、发光信号变化等参数，分析实验结果。可使用统计学方法对数据进行处理，以得出有意义的结论。

3. 多图分析：不同时间点成像结果的分析要用到多图分析，数据归一化有助于消除偏差，批量ROI圈选及计算，生成动力学曲线、批量导出图片及动态展示等提高了结果的可读性和理解性。

结论

综上所述，生物发光活体成像在实验过程中涉及多个环节，掌握各个方面的技巧和方法对于获得可靠、准确的实验结果至关重要。

Q&A

最后在仪器操作方面，为大家提供的常见的一些问题及解决方法：

1. 正常成体小鼠可以看到体内发光吗？是否不需要裸鼠？

可以。成体老鼠和裸鼠，幼鼠及胚胎的区别只在于对可见光的穿透性不同，通过仪器可以看到正常老鼠的体内发光。可见光的穿透能力在3-4cm，所以大鼠也可以作为活体成像的动物。

2. 拍摄图片模糊不清可能原因是什么？怎么解决？

可能是焦距没有调整到位，预览状态下拍摄样本就不清晰。

解决方法：重新调整样品台高度，并使用聚焦按钮进行精确调焦，确保拍摄主体清晰。

3. 预览曝光时间怎么调整？

预览曝光可以帮助您更清晰地观察样品，并优化拍摄效果，预览曝光时间应根据样品的亮度和对比度进行调整。在预览模式下，点击曝光时间显示区域，输入新的曝光时间值，或使用上下箭头按钮进行调整。同时观察预览图像效果，直到找到合适的曝光时间，保证图像清晰，避免过曝或欠曝。

4. 拍摄图片曝光过度或不足怎么解决？

调整曝光时间，根据样品信号强度选择合适的曝光时间，可以选择手动曝光模式，根据实际情况手动设置曝光时间。

5. 实际拍摄时，我到底是使用手动曝光（固定曝光时间）还是自动曝光？

从实验设计角度看，手动曝光是可以的，每个时间点的曝光时间固定，后期可以放在一起比较。但从实际操作角度来看，曝光时间具体多少很难确定，很容易过曝或者拍不出信号。

推荐使用自动曝光，多图分析时切换到时间归一化单位（cts/s,photons/s,p/s/cm2/sr等）就可一起比较。

6. 图片分析结果不准确怎么解决？

分析结果不准确可能是由于ROI 选区不准确，或者背景扣除不当。应仔细选择 ROI 选区，确保只包含目标信号区域，避免包含背景或非特异性信号。调整背景扣除参数，去除背景信号的影响，确保分析结果的准确性。

7. 软件运行出现错误怎么解决？

软件运行出现错误可能是由于软件版本与硬件不兼容，或者软件安装不完整。应确保软件版本与硬件兼容，参考软件安装指南重新安装，确保软件安装完整。

8. 软件支持哪些图片格式，源文件怎么保存？

软件支持多种图片文件格式，例如 TIFF、JPEG、PNG 等。可以根据需要进行选择合适的图片文件格式保存，例如 TIFF 格式可以保存图片的完整信息，但文件体积较大；JPEG 格式可以压缩图片，但会丢失一些信息。

源文件会自动保存，软件默认的源文件保存路径为硬盘最后一个分区:\Capture Images\当天日期，你可以根据需要进行修改保存路径，例如可以将图片文件保存到指定的文件夹或硬盘分区中。

9. 软件出现“相机未连接”或“控制板未连接”怎么解决？

出现“相机未连接”或“控制板未连接”可能是由于USB 数据线连接问题或USB 驱动问题，请检查 USB 数据线是否牢固地连接到主机后侧的 USB 接口和电脑的 USB 接口，确认电脑的 USB 接口是否为3.0接口； 

检查电脑是否已正确安装 USB 驱动程序。您可以尝试重新安装驱动程序。

重启软件和电脑，按照先开电脑，再开软件的顺序重新开启仪器和软件。

如以上步骤未能解决，请联系厂家获取帮助。

10. 多图分析功能如何使用？

IVScope 8000X 系列小动物活体成像系统的 Clinx IVScopeEQ Capture 软件提供了多图分析功能，方便用户进行批量图片的对比分析。允许用户一次性导入多张图片，可以选择不同的排列方式、伪彩样式，并在归一化背景下对多张图片同时进行 ROI 分析，比较不同区域的数据。可以设置不同的 ROI 类型，例如圆形、椭圆形、矩形等，可以导出 ROI 数据。用户可以将多张图片导出为不同的格式，例如 TIFF、JPEG 等，可以选择导出全部图片或部分图片，还可以预览及导出动图。

Clinx IVScopeEQ Capture 软件多图分析功能强大且易用，可以帮助用户更方便地进行批量图片的对比分析，从而获得更准确和可靠的实验结果。