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默克化工技术（上海）有限公司
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ZIC®-HILIC 色谱柱检测可乐饮料中的甲基咪唑
默克密理博应用实验室 2013-07-15
近日，百事可乐的产品在美国10个州中被爆出4-甲基咪唑(4-Methylimidazole)严重超标。4-甲基咪唑是一种有机中间体，主要用于合成大宗胃药西咪替丁，也可用作环氧树脂固化剂和金属表面防护剂等。可乐中的4-甲基咪唑是在以亚硫酸铵为原料生产焦糖色素时产生的。 4-甲基咪唑白色至类白色结晶粉末，易溶于水和乙醇，有腐蚀性，是一种能诱发肿瘤的化学物质。
默克密理博致力于分析方法的开发，为客户提供简便、快速的解决方案。4-甲基咪唑及其异构体2-甲基咪唑均有较强极性，适合使用默克密理博的两性离子型亲水作用色谱柱(ZIC®-HILIC)分离。
本实验采用默克密理博两性离子型（ZIC®-HILIC）色谱柱直接分析甲基咪唑的液相色谱方法。该方法前处理简单，不需要衍生化，也不需要添加离子对试剂。
1 材料试剂
- 对照品：4-甲基咪唑，2-甲基咪唑。
- 色谱柱：ZIC®-HILIC 250-4.6mm 5um 200Å（默克密理博，货号：1.50458.0001）
- 乙腈（默克密理博，货号：1.00030.4008）
- 甲醇（默克密理博，货号：1.06007.4008）
- 磷酸二氢钾（默克密理博，货号：1.04873.1000）
- 可口可乐及百事可乐样品
- 实验用为为超纯水（默克密理博Milli-Q Advantage）
- PVDF0.22um针头过滤器（默克密理博，货号：SLGV033NB）
- 标准溶液配制：使用70%乙腈溶液，分别配制1mg/ml 的4-甲基咪唑，2-甲基咪唑对照品原液。取两个对照品原液，1：1混合、稀释、定容，成，得100ug/ml的混合对照品母液。混合母液用70%乙腈溶液配制浓度为0.1-10ug/mL的标准工作液。
- 样品前处理：取3 ml 可乐饮料样品于5mL容量瓶中，用碱液调节pH值，加水稀释至刻度。混匀，取1mL溶液于10mL容量瓶中, 加8ml 乙腈溶解，超声10min后，冷却至室温，加乙腈稀释至刻度。混匀，静置，分层，取上层清液，过滤。另取3ml可乐，加入标准品后，调节pH值，再同法处理。
2.测试条件
2.1 液相色谱仪：Agilent 1260 HPLC
2.2 色谱条件
色谱柱:ZIC®-HILIC PEEK 250-4.6 5um(1.50458.0001)
流动相: A-磷酸缓冲盐（20mM K2HPO4)，B-乙腈
梯度程序：0-12 min 80% B; 12-15 min 80-50% B, 15-20 min 50% B, Post time: 7 min
检测波长：214nm
柱温:30℃
流速:1mL/min
进样体积: 20ul
3 测试结果
3.1对照品测试
对照
图1 混合对照品溶液(10ug/ml)
表1 对照品测试结果| No. | Compound | Retention Time (min) | Theoretical Plates | Asymmetry | Resolution |
RSD % （n=3） |
| 1 | 4-Methylimidazole | 10.1 | 7135 | 0.80 | - | 2.37 |
| 2 | 2-Methylimidazole | 11.4 | 7857 | 0.79 | 2.46 | 1.44 |
3.2 校准曲线
配制0. 1，0.5，2，5，10ug/ml的对照品溶液，分别进样检测。根据浓度与峰面积值绘制校准曲线。
图2 校准曲线
结果表明，在0.1-10ug/ml之间，线性关系良好。3.3 加标回收及精密度试验
百事可乐样品按照样品处理方法处理，结果显示未检出甲基咪唑，且在4-甲基咪唑和2-甲基咪唑色谱峰附近没有干扰峰。
图3 百事可乐样品
取3mL百事可乐样品，分别加入不同量混合对照品，经过处理后测定，计算加标回收率，见表3。
图4样品加标（蓝色为可乐空白，红色为可乐加标（17ug/ml））
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