小奥课堂 | 高通量组织gDNA提取实践手册来啦！

转眼间就到2020年了

小奥课堂又带着满当当的知识来咯

今天小奥和大家分享的依然是

干货满满的生物研究实践手册
祝大家新年愉快！

Part 1

 —— 前 言 | 

核苷酸提取和纯化的一般过程包括裂解组织细胞，并使细胞内的核酸酶如DNase 和 RNase失活，然后从细胞裂解液中得到核苷酸成分并分离纯化出来。

在裂解组织细胞时，细胞裂解液的选择是非常关键的因素，商业化的裂解液有很多中不同的种类，其组分和组分的配比有非常大的不一样，由于不同机体组织结构的差异如植物细胞有细胞壁而动物细胞没有，需要选择不同类型的裂解液来提高gDNA的提取效率。

裂解液的作用包括以下几个方面：

1.  裂解细胞膜和核酸膜

2.  裂解液保持gDNA结构的完整性

3.  裂解液能够使gDNA能够从细胞碎片中分离，并防止其被酸降解。

4.  在gDNA提取过程中保持裂解液中稳定的PH值。

细胞裂解液的主要化学成分包括Tris, EDTA, SDS, CTAB, Triton X100, MgCl2, KCl, NaCl和其它的洗涤剂。

首先Tris, EDTA是细胞裂解液的主要成分，俗称TE buffer, Tris能够维持裂解液稳定的PH值而EDTA是二价金属离螯合剂，主要作用是使DNase 和RNase 失活； 其次，SDS和CTAB的作用是能够裂解细胞膜，使细胞膜和核膜上的蛋白质失活，再者一些盐类如MgCl2能够阻断脂蛋白的负电从而保护DNA，KCl, NaCl能够中和负电的DNA使DNA较易从细胞中拉出来。

当然细胞裂解时可能也会使用到Triton X100，beta-mercaptoethanol, ascorbic acid等试剂。

值得注意的是，在组织gDNA提取的过程中，通常还会采用Proteinase K蛋白酶进行前处理，采用Proteinase K进行DNA提取的方法到目前为止常用的DNA提取方法之一。

蛋白酶K是一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶，具有很高的比活性，是DNA提取的关键试剂。该酶在较广的pH值范围（4-12.5）内以及高温（50-70摄氏度）均具有活性。EDTA等螯合剂或SDS等去垢剂均不能使之失活。

蛋白酶K是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶，它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键。蛋白酶K能够消化细胞膜和核膜上的各种膜蛋白糖蛋白，同样也能消化和DNA结合的组蛋白。

核苷酸的分离纯化的方法有很多种，很多方法都有商业化的试剂盒提供，现在较为通用的是固相gDNA核苷酸分离纯化的方法，包括以下几个关键的步骤：

1.  细胞裂解液中的gDNA在固相表面的吸附

2.  清洗固相表面，去除固相表面非gDNA的杂质

3.  将gDNA从固体吸附表面洗脱下来得到较纯的gDNA

关于固相表面多为二氧化硅材质，依附在柱子（column）的形式或者磁性微球（bead）的形式，带正电的二氧化硅类材料对带负电的DNA骨架有很强的结合力，钠离子在两者之间起到了阳离子桥的作用。

在pH小于7的情况下，高浓度的钠阳离子打破了二氧化硅材料带负电氧离子和水溶液氢离子的氢键结合，使得DNA能够牢牢地绑在二氧化硅材料上，大量地洗涤能够去除吸附在二氧化硅材料上地DNA以外地其他污染物。

低的离子浓度和pH大于7的情况下，DNA和二氧化硅材料表面的结合力变得十分微弱，较纯的DNA可以从二氧化硅材料表面采用TE缓冲液或者单纯用蒸馏水洗脱下来。

Part 3

 高通量组织gDNA提取方案分享 

1. 将组织切成25mg左右的小块（脾脏组织最多10mg）放入合适的奥豪斯预填充均质裂解管中（针对不同来源的组织裂解管中含有对应直径的锆珠能够对组织进行有效的切割），

加入0.5ml TE buffer,使用奥豪斯高通量生物样品均质器，设置研磨时间为5分钟，研磨速度1500rpm，样品过多可使用深孔板进行裂解。

2.  装载组织裂解液的96孔板中每孔加入10ul proteinase K(20mg/ml),混匀，56℃度下孵育1-3小时直至组织完全裂解。（在孵育过程中涡流混匀效果更佳）。如果需要RNA-free的DNA样品，在孵育完后可平衡到室温后加入RNase消化2分钟。

3.  根据高通量DNA试剂盒的手册，将合适量的裂解液和乙醇加入装载组织裂解液的96孔板中，15s混匀。

4.  96孔连接的DNA结合柱子套上深孔96孔板，将混匀后的裂解液（包括任何的沉淀物）一一对应转移到DNA结合的柱子上，用离心机将96孔板8000rpm离心一分钟。

5.  离心后弃深孔板中的废液，加入试剂盒提供的洗涤液500ul到DNA结合柱子，8000rpm离心一分钟。如果洗涤液有两种，操作两次。

6.  离心后弃深孔板中的废液，96孔板14,000 rpm离心3分钟使酒精挥发。

7.  弃装废液的深孔板，在DNA结合柱子表面下换上干净的96孔板，加入100ul TE缓冲液或者微热的双蒸水到DNA结合柱子表面，放置2分钟以使TE/水浸润，8000rpm离心一分钟。

8.  用微量分光光度仪检测96孔板中DNA的OD值A260,A280和A320,得到纯度和浓度信息。

Part 4

DNA提取和纯化技术有赖于目前成熟商业化的试剂盒已成为生物科学实验室常规的实验技术。

但当样品量过大时，特别是操作难度较大的组织样品时，以常规的1.5ml离心管为体系的gDNA提取和纯化技术依旧是一个费时费力的过程，需要很长的时间和体力劳动，多批次进行提取，这样一个过程有极大的样品混淆，交叉污染的风险。

利用现有的一些便利的仪器和材料如96孔板，96孔DNA结合柱，奥豪斯高通量生物样品均质器进行gDNA提取和纯化将整个过程变得半自动化，将有效的规避前面描述的这些风险，是提高实验室gDNA提取效率和质量的常用的解决方式，也是未来gDNA提取和纯化的发展方向。