光片显微镜中的光束选择

在光片显微镜中，主瓣是指光片中强度最高的区域，它直接影响着显微镜的轴向分辨率。主瓣越薄，理论上分辨率越高。然而，光片的光切片，即整个光片的厚度，同样对成像质量有着决定性的影响。光切片不仅包括主瓣，还包括可能影响对比度的旁瓣或次要结构。

在许多先前的出版物中，未能区分光片厚度和主瓣厚度可能会导致混淆，例如在提到“通过扫描贝塞尔光束产生的超薄平面照明”或“超薄贝塞尔光片”时，主瓣比相同长度的传统高斯光片更薄^【19,25】。对于最常用的具有高斯分布的光片来说，只有一个光片，主瓣厚度和光片厚度的测量值严格成比例。但如图1 所示，这对于具有辅助结构（如侧瓣或多条平行光片）的多瓣光束并不适用。

对于多瓣光束，当仅考虑主瓣厚度时，样品暴露的总照明功率中有相当一部分被忽略。这种额外的曝光会在光片显微镜中贡献到检测到的荧光信号，从而可能降低图像对比度。因此，考虑以下几点非常重要：通常显示的沿检测轴的 PSF 切片可以用来推断轴向分辨率。然而，它们使观察者无法计光学分层性能或光片厚度。

光片的长度是另一个关键参数，它决定了可以均匀照明的样本区域大小。较长的光片可以覆盖更大的视野，但可能会牺牲一些分辨率。

分辨率是衡量显微镜性能的基石，它决定了我们能看到的最小细节。而对比度则是图像中亮区与暗区的差异，高对比度意味着更清晰的图像细节。在光片显微镜中，主瓣的厚度和光切片的均匀性共同决定了分辨率和对比度：

激光强度是生成光片的基础。不同强度的激光可以产生不同特性的光片。例如，高强度激光可以生成更薄的主瓣，但也可能增加样品的光漂白和光毒性。

图 2. 主峰厚度和光学分层的定义。展示了单峰光束 (a) 和多峰光束 (b) 的强度在 yz 方向上的横截面。在焦点处 (紫色线) 和距离 y = L 处 (厚度加倍的地方, 蓝色线) 的相应剖面显示在 c-j 中。c, d 和 e, f 分别说明了单峰光束 (c, d) 和多峰光束 (e, f) 的主峰厚度，定义为在焦点处强度高于最大强度 37% 的范围，分别在焦点处 (c, e) 和距离 y = L 处 (d, f)。子图 g-j 相应地说明了光学切片厚度 wOS ，定义为包含光束功率 63% 的范围。

观察由扫描光束形成的光片时，相关的测量包括：

第一个测量标准提供轴向分辨率，而第二个提供对比度。轴向分辨率是沿检测 z 轴可以分辨出两个物体的最小距离。对比度是聚焦特征信号与背景信号（主要来自失焦特征）的差异。图 2a 显示了由单峰光束形成的光片的示例。图 2c 和 2d 显示了在光束传播轴上两个位置处以 1/e=37% 峰值强度测量的分布宽度，图 2g 和 2h 显示了标记光束总能量 63% 的积分轮廓。在强度大于峰值强度 37% 的范围内，高斯强度分布的光片携带其总能量的 84%。原因在于光片不是一个圆对称光束，而是主要沿检测轴向一个方向扩展。

在比较不同光片时，第一个测量标准（强度下降）与第二个测量标准（区域内包含的能量）之间的比例与任何长度的单峰光片的比例数值无关。

对于多峰光片来说，第一个和第二个测量标准得到的值可能会有显著差异，因为它们表现出更复杂的结构。如图 2 右侧所示，强度分布降到峰值的 1/e 的距离仅反映了主峰的厚度（图 2e, f）。因此，作者引入了“主峰厚度”这个术语来表示这个测量标准。图 2i, j 中标示的光学分层 w_OS 考虑到主峰可能不具备足够的能量来贡献总检测信号的 63%。

这一测量标准给出的值明显大于主峰厚度，更接近反映了光片的真实厚度。

在实际应用中，这些性能参数之间存在着协同与权衡。例如，追求更薄的主瓣以提高分辨率可能需要牺牲一些光切片的均匀性，从而影响对比度。同样，增加激光强度以改善信噪比，也可能带来光漂白的风险。

图2. 各种光束类型相对于高斯光束的光学分层（蓝色）和主瓣厚度（橙色）的比率。所有值均为光束长度 L 约为 30 µm 计算得出。插图显示了解释图表的方案。值大于 100% 表示主瓣或光学分层比高斯光束更厚。

对于所有类型的光片显微镜，光学切片和轴向分辨率取决于光片的长度。因此，仅在长度相等的情况下比较光片特性是至关重要的。在大多数情况下，长度是由样品或研究人员希望在单帧中观察的视野决定的。

因此，作者选择首先定义光片长度的方法，然后根据它们提供的轴向分辨率和光学切片来比较光片。

将高斯光束设为参考值，作者计算了相同光束长度下不同光束类型在厚度和光学切片方面的相对增益或损失。

图2显示了长度为30 µm的光片的结果。数值超过100%表明光片厚度 w_OS 或主瓣宽度w_ML大于高斯光束。

总体而言，作者发现对于所有光束类型，在这两个特性之间存在权衡：制造薄光片会以高斯光束的长度或其他光片类型的光学切片为代价。

光片显微镜的技术选择是一个综合考量的过程，需要在分辨率、对比度、光切片质量和激光强度之间找到最佳的平衡点。通过深入理解这些技术参数及其相互关系，您可以更加自信地选择和优化适合自己研究的光片显微镜技术。

* E. Remacha “Light Sheet Simulator” (2019) [retrieved 5 November 2019]

https://github.com/remachae/beamsimulator

在Matlab环境中运行LightSheet_Simulator.mlapp，图3显示了GUI示例。有三种可能的操作：

图3. 光束模拟器用户界面

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