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文献解读：光栅光片与高斯光片的系统性和定量比较

徕卡显微系统

2024/07/12 17:51

阅读：4

光片荧光显微镜简介

光片荧光显微镜（LSFM）是一种快速发展的体积成像技术，因其速度快、灵敏度高、光学分层能力强以及低光毒性和低光漂白而受到生命科学家的青睐。在LSFM中，生物标本被聚焦的光片照亮，荧光通过现代科学相机以宽视场格式捕获。与传统的表面荧光成像方法不同，LSFM限制了对焦区域以外的潜在有害照明，从而减少了光毒性和光漂白，提高了成像对比度。

在《Systematic and Quantitative Comparison of Lattice and Gaussian Light-Sheets》一文中，作者Bo-Jui Chang、Kevin M. Dean和Reto Fiolka 系统比较了基于不同光束光片的物理性质。尽管近年来新的光束因其窄光腰和传播不变特性受到关注，但关于其物理性质及其与标准高斯光束相比的研究却很少。本文通过实验测量了最常用的方形光栅光片和高斯光片的光束特性，发现两者在厚度、共焦参数、传播长度和整体成像性能方面非常相似。本文旨在对这些研究结果进行解读，明确其对光片荧光显微镜（LSFM）领域的研究人员和实践者的影响。

关键概念和方法

这篇文章重点讨论了两种主要的光片类型：高斯光束和常用于LLSM的抖动方格光栅(dithered square lattice)。作者详细介绍了生成和分析这些光片的实验设置，包括使用488纳米激光器、空间光调制器以及各种光学元件来成形和测量光片。

图1.由方形光栅和高斯光片照明的3D图像堆叠中的珠子在YX和YZ最大强度投影（MIP），传播长度分别为(A) 12 μm, (B) 19 μm, (C) 32 μm 和 (D) 40 μm。

表格1. 方形光栅和高斯光片的横向和轴向分辨率是通过100纳米荧光纳米球测量的。使用双样本T检验评估统计显著性。

在40um 传播长度处，高斯光束表现出更好的轴向分辨率。

光片特性的测量包括以下三个参数：

光束束腰处Z方向的光片厚度。

Y方向的光片传播长度。

共焦参数，测量光片厚度增加到其最小值的√2倍的距离。

光片特性的比较

光束厚度和传播长度

研究表明，高斯光片和方格光栅光片在光束腰厚度和传播长度方面表现出相似的特性。这一发现具有重要意义，因为它挑战了之前认为光栅光片由于其传播不变性而具有更优越的轴向分辨率的观点。

图2. 高斯光片和方形光片显微镜的点扩散函数 (PSF) 和光学传递函数 (OTF)。(A) 数值孔径 (NA) 为 0.31、0.24 和 0.14 的高斯光片，以及数值孔径为 0.70 和 0.56、0.55 和 0.44、0.35 和 0.28 的方形光片的光束轮廓。展示了 YZ 和 XZ 的横截面视图。每个光片在中心（最薄的腰部）的 XZ 视图。箭头指向有用光片边缘和方形光片旁瓣的不同之处。NA：用于方形光片的环形外数值孔径；na：用于方形光片的环形内数值孔径。(B) 沿传播方向的光束大小测量。(C) 光片厚度的测量。

光学性能

作者细致地测量了两种光片的点扩散函数（PSF）和光学传递函数（OTF）。

图3. 方形光栅和高斯光片显微镜的点扩散函数（PSF）和光学传递函数（OTF）。所有PSF和OTF图像均应用了0.8的伽马校正，以增加弱特征的对比度。选择具有类似共焦参数的高斯光片以与光栅光片进行比较。PSF的比例尺为1 μm。

结果表明，高斯光片和方格光栅光片具有相似的PSF和OTF，表明它们在实际应用中的成像性能几乎没有区别。

共焦参数

两种光片在光片厚度与共焦参数之间表现出相似的关系。然而，由于生成和调节这些光束的复杂性，方格光栅光片表现出略大的可变性。

图4. (A) 光片厚度与光片传播长度的关系。厚度的测量方法如图1(C)所述，传播长度的测量方法如图1(D)所述。(B) 光片厚度与共焦参数的关系。共焦参数的测量方法见原文。

实验结果

研究表明，大多数LLSM实验可以使用传统的高斯光片完成，从而简化了系统的组装、对准和操作。此外，使用高斯光片所需的激光输入功率更少，并且更容易实现多色同时激发。研究结果强调了线性光学中的基本物理定律，即随着共焦参数的增加，光片厚度和旁瓣强度也会增加。

图5. 宽场、高斯光片显微镜和方形光栅光片显微镜的PSF和OTF。为了增强弱特征的对比度，所有PSF和OTF图像均应用了0.5的伽马校正。沿OTF中心虚线的剖面图（未进行伽马校正）清晰显示了OTF的支持范围。PSF中的比例尺为1 μm。

实践意义

研究结论表明，对于大多数LLSM应用，传统的高斯光片与方格光栅光片的性能相当。这对LSFM系统的设计和使用具有实际意义，表明无需复杂的光栅配置，使用更简单、更直观的高斯光片即可实现类似的结果。

本文为荧光显微技术领域做出了重要贡献，提供了清晰且数据驱动的比较，可以指导未来光片成像技术的研究和发展。

参考文献：

Chang, B-J., Dean, K. M., & Fiolka, R. (2020). Systematic and quantitative comparison of lattice and Gaussian light-sheets. Optics Express, 28(18), 27052-27065. DOI: 10.1364/OE.400164