基于激光显微切割-液质联用技术的微量细胞广靶脂质组学分析

徕卡显微系统

2024/05/24 17:37

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活细胞无时不在与外界进行着物质和能量的交换，其代谢水平应是其生命体征的主要表现。在健康和疾病中，代谢程序和它们所支持的特定生理功能之间有着密切的联系。这些核心代谢功能的失调与许多现代疾病有关。由于每个细胞都生活在一个独特的环境中，我们体内没有一个细胞在新陈代谢、表型和功能上完全相同。在单细胞分辨率下，解决代谢的时空异质性将推动代谢领域向前发展，并转换到临床应用和理解体内系统代谢组学变化的基础。

相比DNA和RNA，细胞内的代谢物无法扩增，单个细胞能够提供的用于分析的代谢物浓度低体积小，对分析设备和方法的要求较高。因此，本次研究将具有单细胞取样精度的激光显微切割 (LMD, Laser Microdissection)技术和SCIEX 7500高灵敏度质谱系统联合使用，测试在能够用于有效分析的细胞数量。

实验设计

样品制备：

脑组织做冰冻切片，样本置于激光显微切割载物台；接收端放置PCR管用于分离体的接收。选择合适的细胞数目或切割面积（如~2000μm²），在调节好相关参数（Power 49、Aperture 5、Speed 13、Bridge size 4）后开始进行切割（图1）。切割完成后，小心将PCR管取出，由管底倒扣至管盖盖紧，防止管盖中收集的样品遗落。

图1. 脑组织切片样本用于激光显微切割分离体制备。在40倍放大视野中选取合适的面积，约2000 μm2（左）进行切割分离并用于后续分析；一份样品切割分离完成后（右），可继续选择其他区域进行操作。

样品提取：

装有样品的PCR管在vortex中振荡5s，由点甩小型离心机将微量样品离心至管底，小心打开管盖，加入30 μL提取溶液（异丙醇:乙腈:水 30:65:5 v/v/v），振荡混匀，超声15 min，离心后将全部溶液转移至进样小瓶中待LC-MS/MS分析。LC-MS条件：样品通过ExionLC^™系统串联SCIEX 7500系统，进行分析。数据通过SCIEX OS 软件2.1中的定量功能进行处理。

分析结果

在分离的微量细胞中（组织切片约2000μm²），共检测到285个脂质化合物，包括鞘脂SM、胆固醇酯CE、甘油三酯TAG、甘油二酯DAG、磷脂酰乙醇胺PE、磷脂酰胆碱PC、神经酰胺Cer7类。

图2.微量脑组织切片中测得的不同种类脂质化合物的数量。基于LC-MS/MS 的靶向脂质组学方法快速分析基质中的多种脂类物质。

图3.对于微量细胞中检测到的脂质化合物的判定，主要基于与空白提取溶剂（阴性对照）和血浆脂质提取样本（阳性对照）共同比较，并且结合各类脂质标准品出峰位置情况、同类脂质化合物有较为接近的出峰位置，而同类脂质化合物连接脂肪酸链越长保留时间越靠后、连接相同碳数的脂肪酸链上不饱和键数越多保留时间越靠前的规律，对微量样本中检出的脂质化合物做定性判断。