林可霉素(Lincomycin,又称洁霉素)主要用链霉菌发酵得到。常作用于细菌核糖体的50s亚单位,通过抑制肽链的延长而抑制细菌蛋白质的合成,从而清除细菌表面A蛋白质和绒毛状外衣,使其易被吞噬和杀灭。林可霉素对机体免疫系统有增强免疫调节,使得多核型白细胞的吞噬和杀菌功能增强,改变细菌表面活性,抑制细菌毒素的产生。可用于治疗革兰氏阳性菌和支原体感染,对葡萄球菌、链球菌作用较强,对厌氧菌有抑制作用,在许多感染症的治疗中疗效显著。用作饲料添加剂时,可促进肉鸡和育肥猪的生长。林可霉素造成的动物源性食品安全问题备受人们关注,因此,欧盟和我国对动物源性食品中林可霉素限量做了严格规定,其最大残留量为1µg/kg。
1.样品提取
称取5.0 g(精确到0.01 g)均质好的样品,置于50 mL离心管中,加入15 mL乙腈,用均质器均质1 min,在振荡器上振荡10 min,4200 rpm离心5 min,取上清液于另一50 mL离心管中;再加入10 mL乙腈于样品残渣,重复提取一次,合并上清液于50 mL离心管中,加入2.0 g氯化钠和10 mL正己烷,于振荡器剧烈振荡10 min,以4200 rpm离心10 min,小心吸取中间乙腈层10 mL于另一离心管中,55℃水浴氮气浓缩至近干。用7 mL磷酸盐缓冲液分两次溶解残留物,作为待净化液。
2.净化方法
先将Cleanert® PEP-2 (500mg / 6mL)小柱分别用10 mL甲醇,10 mL水,5 mL 0.2%氯化钠,5 mL磷酸盐缓冲液活化平衡;然后将待净化液过柱(流速控制在1 mL/min);用10 mL水和5 mL甲醇-水(2:3,v/v)洗柱,弃去全部流出液,小柱用真空泵抽干15 min;最后用10 mL甲醇洗脱。收集洗脱液于45℃氮气吹干,用1 mL 10 mmol乙酸铵溶液(含0.15%甲酸)溶解残留物,过0.22 µm滤膜后待测。
3.检测方法
3.1色谱条件
色谱柱:Venusil® ASB C18,
2.1×100 mm,5 µm,150 Å;
流动相:A相-0.3%甲酸水溶液,B相-0.3%甲酸乙腈
柱温:35℃;
进样量:10 µL;梯度洗脱:见表1
表 1 液相色谱梯度洗脱条件
时间(min) | 流速 (mL/min) | A/% | B/% |
---|---|---|---|
0.00 | 0.25 | 95.0 | 5.0 |
2.00 | 0.25 | 95.0 | 5.0 |
5.00 | 0.25 | 5.0 | 95.0 |
6.00 | 0.25 | 5.0 | 95.0 |
6.01 | 0.25 | 95.0 | 5.0 |
10.00 | 0.25 | 95.0 | 5.0 |
3.2质谱条件
离子源:电喷雾离子源
扫描方式:正离子扫描
电喷雾电压:5500 V 雾化气压力:45 psi
气帘气压力:15 psi
辅助气压力:50 psi
离子源温度:550℃
采集方式:多反应监测(MRM)
Q1、Q3均为单位分辨率质谱参数(见表2)
4.实验结果
由表3可知,采用固相萃取结合液相色谱-串联质谱法检测林可霉素加标回收率在84%~105%之间,RSD值小于 10%,能够满足检测要求。由图1可看出经Cleanert® PEP-2固相萃取柱净化,采用Venusil® ASB C18色谱柱检测得到的林可霉素峰形良好,且保留时间稳定。
图 1 林可霉素样品加标 1.0μg/kg 液相色谱/ 串联质谱质量色谱图
结论:
本实验建立了林可霉素残留量的LC-MS/MS检测方法,并结合固相萃取技术对猪肉中林可霉素的含量进行了测定。对于加标量为1.0 µg/kg的样品进行了检测,回收率在84%~105%,符合国标要求,固相萃取方法稳定并且色谱柱重现性良好,说明本方法能够用于检测动物源性食品中林可霉素的残留量。
5.订货信息
产品名称 | 规格包装 | 订货号 |
---|---|---|
Venusil® ASB C18 | 5µm,150Å,2.1×100mm | VS951002-0 |
Cleanert® PEP-2 | 500mg/6mL,30/pk | PE5006-2 |
保护柱套 | 适用于4.6×10mm和2.1×10mm | SH-100 |
直联式保护柱芯 | 5µm,150Å,2.1×10mm | VS950102-0S |
1.5 mL样品瓶 | 短螺纹透明带书写32×11.6mm,100/pk | 1109-0519 |
1.5mL样品瓶盖 | 9 mm中心孔蓝盖,红色橡胶/米色PTFE隔垫,45.Shore A 1.0 mm,100/pk | 0915-1819 |
微孔滤膜(Nylon) | 13mm,0.22µm,200/pk | AS021320 |
一次性注射器 | 2mL两件式 无针头,100/pk | LZSQ-2ML |
乙腈UV级 | 4L/瓶,色谱纯 | 015-4 |
正己烷HPLC | 4L/瓶,色谱纯 | AH216-4 |
甲醇 | 4L/瓶,色谱纯 | S230-4 |
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