【飞诺美色谱】婴幼儿奶粉中双氰胺的检测方法（HPLC-UV 和 HPLC-MS/MS 法）

北京时间 1 月 25 日凌晨消息，新西兰牛奶中发现了有害物质——双氰胺。双氰胺又名二氰二胺，缩写 DICY 或 DCD。虽然国际标准未对食品中的双氰胺限量，但高剂量的双氰胺对人体是有毒的。

针对婴幼儿奶粉中基质复杂的特点，本方法加大了净化材料的用量，以获得了更好的净化效果。采用天津博纳艾杰尔科技的新一代的 Cleanert® MAS-QuChERS-双氰胺净化管（500mg/15mL，货号： MS-SQA02）和 Venusil® HILIC 液相色谱柱，建立了奶粉中双氰胺的 MAS-QuEChERS 快速前处理方法和 LC-UV 以及 LC-MS/MS 检测方法。


1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

高效液相色谱仪，涡旋振荡器，超声波清洗机，氮吹仪。

双氰胺标准品（CAS： 461-58-5；FW=84.08），新一代Cleanert® MAS-QuChERS-双氰胺净化管， Venusil® HILIC液相色谱柱，微孔滤膜，乙酸铵、乙酸、乙腈为色谱纯，实验用水为超纯水。

表 1 双氰胺的信息

1.2 实验步骤

称取 1g 试样于 50mL 具塞离心管中，加 2mL 水，涡旋 30s，加 2ml 乙腈涡旋 30s。再往现有的提取液中加 2mL 乙腈，重复上述提取步骤。再将该提取步骤重复 2 次，得到共计约 10mL 的提取液。以 4000r/min 离心 5min，将全部上清液加入新一代 Cleanert® MAS-QuChERS 管中（500mg/15mL）， 将 MAS 管上下晃动 30s，然后涡旋 30s 后，8000r/min 离心 5min，取全部上清液（约 10ml）于玻璃试管中，50℃下氮气吹干，加入 1ml 乙腈复溶，过 0.22μm 微孔滤膜，待测。

注：1.做基质加标实验时的标准溶液建议选择以水为溶剂，防止加标瞬间发生蛋白沉淀；

2.乙腈提取分 4 次，为防止乙腈体积过多时沉淀蛋白速度过快，影响提取效果。

1.3 实验条件

1.3.1 高效液相色谱法（HPLC 法）：

色谱柱：Venusil® HILIC（5μm，100Å，4.6*250mm）；

流动相： 10mmol/L 乙酸铵（pH=4.0）：乙腈=15: 85；

波长：220nm；进样量：10µl；柱温：30℃；流速：0.8mL/min。

1.3.2 LC-MS/MS 法：

（1） 色谱条件：
色谱柱：Venusil® HILIC（ 5μm，100Å，2.1*150mm）；

流动相：

A：0.5mmol/L 乙酸铵（pH=4.0）
B：乙腈；
进样量：10µL；柱温：30℃；流速：0.3 mL/min。

表 2 流动相梯度程序

*备注：本文曾尝试过多种 C18 色谱柱，对双氰胺没有保留，需要使用离子对试剂，但是无法用于 LC-MS/MS；也曾尝试过 MERCK ZIC-HILIC 柱，但是得到双氰胺的峰面积偏差较大，分析原因是其具有阳离子交换基团，对双氰胺有不稳定的死吸附。最后确定使用键合丙基酰胺的 Venusil HILIC 柱，以亲水作用色谱机理对双氰胺进行保留。

（2） 质谱条件：

质谱仪：API 4000+；离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测； CAD：8.00；CUR：20.00；GS1：60.00；GS2：50.00；IS：5500.00；TEM：600.00。

表 3 双氰胺质谱信息

注：带“ ”的监测离子对为定量离子对。

2 结果与讨论

2.1 高效液相色谱法：

2.1.1 双氰胺的液相色谱图

图 1 双氰胺 1µg/ml 标准溶液的液相色谱图

2.1.2 实际样品基质加标的线性关系和检出限

准确称取双氰胺标准品 50mg 于 50mL 容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为标准贮备液；

分别称取 1g 奶粉试样，添加一定量标准溶液，配制成含双氰胺为 0.5µg/g，1µg/g，2µg/g，5.0µg/mL和 10µg/g 的添加样品，按照上述提取、净化方法操作，所得净化液按照上述色谱条件，依次进样检测。以双氰胺含量为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表 4：

表 4 双氰胺线性方程和定量限（HPLC 法）

2.1.3 准确度和精密度

选取市售某品牌婴幼儿奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表 5

表 5 0.5µg/g 添加回收实验结果（HPLC 法）

图 2 婴幼儿奶粉空白液相色谱图

图 3 婴幼儿奶粉 0.5µg/g 添加双氰胺的液相色谱图

2.2 LC-MS/MS 法

2.2.1 双氰胺的 LC-MS/MS 图

图 4 双氰胺 10ng/ml 标准溶液质谱图

2.2.2 实际样品基质加标的线性关系和检出限

准确称取双氰胺标准品 50mg 于 50mL 容量瓶中，加水溶液并稀释至刻度，作为标准贮备液；

分别称取 1g 奶粉试样，添加一定量标准溶液，配制成含双氰胺为 5ng/mL，10ng/mL，50ng/mL，100ng/mL 和 200ng/mL 的添加样品，按照上述提取、净化方法操作，所得净化液按照上述液质条件， 依次进样检测。以双氰胺含量为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表 6：

表 6 双氰胺线性方程和定量限（LC-MS/MS 法）

2.2.3 准确度和精密度

选取市售某婴幼儿奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表 7。采用空白样品稀释法判断检测方法的基质效应影响。空白净化液稀释和乙腈稀释的标准溶液，双氰胺峰面积和相对丰度比无明显变化，故判断该方法无基质效应的影响。

表 7 10ng/g 添加回收实验结果

图 5 婴幼儿奶粉空白质谱图

图 6 婴幼儿奶粉 10ng/g 添加水平的质谱图

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