【飞诺美色谱】奶粉中双氰胺的检测方法（HPLC-UV 和 HPLC-MS/MS 法）

北京时间 1 月 25 日凌晨消息，新西兰牛奶中发现了有害物质——双氰胺。双氰胺又名二氰二胺，缩写 DICY 或DCD。虽然国际标准未对食品中的双氰胺限量，但高剂量的双氰胺对人体是有毒的。

本文采用天津博纳艾杰尔科技的Cleanert® MAS-QuChERS-双氰胺净化管和 Venusil® HILIC 液相色谱柱，建立了奶粉中双氰胺的 MAS-QuEChERS 快速前处理方法和 LC-UV 以及 LC-MS/MS 检测方法。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

高效液相色谱仪，涡旋振荡器，超声波清洗机，氮吹仪。

双氰胺标准品（CAS： 461-58-5；FW=84.08），Cleanert® MAS-QuChERS-双氰胺净化管，Venusil® HILIC 液相色谱柱，微孔滤膜，乙酸铵、乙酸、乙腈为色谱纯，实验用水为超纯水。

图 1 双氰胺分子式

1.2 实验步骤

提取、净化：称取 1g 试样于 50mL 具塞离心管中，加入 2mL 水溶解后，加乙腈定容至 10mL，超声 10min，8000r/min 离心 5min，取 2mL 上清液加入Cleanert® MAS-QuChERS-双氰胺净化管填料， 涡旋 0.5min，8000r/min 离心 5min，取上清液过 0.22µm 滤膜，待测。

1.3 实验条件
1.3.1 高效液相色谱法（HPLC 法）：

色谱柱：Venusil® HILIC（5μm，100Å，4.6*250mm）；

流动相： 10mmol/L 乙酸铵（pH=4.0）：乙腈=10: 90；

波长：220nm；进样量：10µl；柱温：30℃；流速：1mL/min。

1.3.2 LC-MS/MS 法：

（1） 色谱条件：
色谱柱：Venusil® HILIC（ 5μm，100Å，2.1*150mm）；
流动相： 0.5mmol/L 乙酸 铵（pH=4.0）：乙腈=10:90；进样量：10µL；柱温 ：30℃；流速：0.2 mL/min。

（2） 质谱条件：
质谱仪：API 4000+；离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；

CAD：8.00；CUR：10.00；GS1：60.00；GS2：50.00；IS：5500.00；TEM：500.00。

表 1 双氰胺质谱信息

注：带“____”的监测离子对为定量离子对。

2 结果与讨论

2.1 高效液相色谱法：

2.1.1 线性关系和检出限
准确称取双氰胺标准品 50mg 于 50mL 容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为标准贮备液； 分别量取一定量的标准贮备液，用乙腈稀释，配置成浓度为 0.1µg/mL，0.5µg/mL，1.0µg/mL，2.0µg/mL，5.0µg/mL 和 10.0µg/mL 的标准溶液，按照上述色谱条件，依次进样检测。以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表 2：

表 2 双氰胺线性方程和定量限（HPLC 法）

2.1.2 检测方法稳定性考察

选用 10.0µg/mL 的标准溶液连续进样 6 针，计算其保留时间和峰面积的 RSD 值，结果见表 3：

表 3 检测方法定性和定量稳定性考察考察（HPLC 法）

图 2 双氰胺 0.5µg/mL 标准溶液谱图（HPLC）

图 3 定性定量稳定性考察谱图（HPLC 法）

2.1.3 准确度和精密度

选取市售某品牌奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表 4

表 4 10µg/g 添加回收实验结果（HPLC 法）

图 4 奶粉空白谱图（HPLC 法）

图 5 奶粉 10µg/g 添加水平谱图（HPLC 法）

2.2 LC-MS/MS 法

2.2.1 线性关系和检出限

准确称取双氰胺标准品 50mg 于 50mL 容量瓶中，加水溶液并稀释至刻度，作为标准贮备液。

分别量取一定量的标准贮备液，用乙腈稀释，配置成浓度为 5ng/mL，10ng/mL，20ng/mL，50ng/mL，100ng/mL 和 500ng/mL 的标准溶液，按照上述液质方法，依次进样检测。以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见下表 5：

表 5 双氰胺线性方程和定量限（LC-MS/MS 法）

2.2.2 检测方法稳定性考察

选用 50.0ng/mL 的标准溶液连续进样 6 针，计算其保留时间和峰面积的 RSD 值，结果见表 6：

表 6 检测方法定性和定量稳定性考察考察（LC-MS/MS 法）

2.2.3 准确度和精密度

选取市售某品牌奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表 7。采用空白样品稀释法判断检测方法的基质效应影响。空白净化液稀释和乙腈稀释的标准溶液，双氰胺峰面积和相对丰度比无明显变化，故判断该方法无基质效应的影响。

表 7 100ng/g 添加回收实验结果

图 6 10ng/mL 双氰胺标准溶液质谱图

图 7 奶粉空白质谱图

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