疫苗前沿｜冷冻干燥技术助力新型mRNA疫苗研发与生产

第四轮新冠疫情在全球的爆发，就在近几日，上海疫情感染总数也突破10万人次大关，感染人数不断上升，但这不仅仅是因为上海防控措施的原因，更因为病毒没有一刻停止过进化。目前国外甚至又进化出两种新的“毒王”。随着大家对疫情的关注度迎来又一波热潮，对疫苗的关心和问题也冲上热搜。

目前不同厂家的疫苗有什么区别？为什么有的疫苗只需接种一剂，有的则需要接种两剂或三剂？应该选择什么类型的疫苗？不同疫苗的有效性是否有差异？疫苗加强针是否应该接种，该怎么选择？有没有有效性更高、且稳定性好的疫苗？

关于疫苗研发的5条技术路线

我们先来了解一下什么是疫苗？

疫苗是预防和控制传染病最经济、有效的手段，疫苗接种是通过诱导机体产生保护性免疫应答来预防和控制人类和动物疾病的常规方法。自新冠疫情初期开始，我国与全球主要国家就投入了新冠疫苗的研发工作，并行开发了5条技术路线的疫苗，这也是目前疫苗的主要分类。

疫苗的不同技术路线：

※ 灭活疫苗

※ 减毒活疫苗

※ 基因工程亚单位疫苗

※ 腺病毒载体疫苗

※ 核酸疫苗

（含DNA和RNA疫苗）

灭活疫苗是最传统的平台，而亚单位蛋白疫苗在过去几十年中蓬勃发展，核酸和病毒载体疫苗是该领域重要的新生事物。核酸疫苗使用先进的基因工程RNA或DNA产生一种自身可以安全诱发免疫应答的蛋白质。相较于DNA而言，RNA更容易被人体识别并产生相应的抗原信息，但不会参与细胞内DNA的改造，因而更加高效且安全性更高。

不同疫苗的有效性如何呢？

此次新冠疫苗在产量方面处于领先地位的是美国辉瑞-BioNTech和Moderna（mRNA疫苗）、阿斯利康和强生（病毒载体）以及中国国药集团和科兴（灭活）。各疫苗的有效性如何呢？世界卫生组织公布的数据如下：

从数据来看，辉瑞-BioNTech和Moderna（mRNA疫苗）有效性较高，分别为95%和94.1%。

为了应对新冠病毒的持续变异，建议尽早接种新冠疫苗加强针。为确保同等或更有利的免疫原性或疫苗有效性，在*剂和第二剂接种灭活疫苗后，视产品供应情况，第三剂既可继续接种同品牌的灭活疫苗，也可接种世卫组织紧急使用列表中的任一种COVID-19 mRNA 疫苗（辉瑞或莫德纳）或COVID-19病毒载体疫苗（阿斯利康Vaxzevria/COVISHIELD或杨森）。

mRNA疫苗的优势在哪里？

代表着未来新技术的mRNA疫苗是将外源靶抗原的基因序列通过转录、合成等工艺制备的mRNA通过特定的递送系统导入机体细胞，通过在体内表达目的蛋白，刺激机体产生特异性免疫学反应，从而使机体获得免疫保护的一种核酸制剂，能实现体液与细胞的双重免疫，有效性高。

mRNA疫苗作为一种平台型技术，在设计和构建上具有快速性、应变性以及简单的全合成制备等优势，新型冠状病毒肺炎在全球范围爆发和蔓延后，随着Moderna和BioNtech公司的mRNA疫苗在临床上的安全性和保护效力得到进一步验证，使得mRNA疫苗技术得到广泛关注并推动了其快速发展。

冷冻干燥技术在mRNA疫苗研发和生产中的应用

mRNA疫苗虽然有效性高，但在生产和使用过程中依然存在一些挑战——

① 结构不稳定；

② 容易被环境中普遍存在的RNA酶降解破坏；

③ 需要在零下-20℃～-70℃之间保存。

这就意味着全程需要冷冻储存和冷链运输，配送和使用会变得非常困难，尤其是对于医疗条件和运输条件相对较差的非洲、南美洲和部分亚洲国家等，因此会造成由于无法按时接种*导致仍有数百万人死于这些疾病。

                                                                                    图2：冻干疫苗可以解决储存运输难题

而这些难题可以通过冻干生产相对较为干燥的产品来解决。目前，冷冻干燥技术由于其独特的优势，已被广泛应用于抗体、疫苗等生物制药中。

1、冻干疫苗的优势

●   疫苗制剂在预冻前完成分装，从而保证了剂量的精确性；

●   由于冻干是在真空和低温状态下完成的，因此不易发生氧化和热变性，可以*限度地保持疫苗的理化性质和生物特性；

●   固态的冰晶升华成为水蒸气后形成的疏松多孔（海绵状）结构，使冻干疫苗具有极好的速溶性和复水性，可迅速吸水溶解，恢复其原有特性；

●   冻干疫苗易进行无菌化操作，污染相对减少，临床应用效果好，过敏等副作用少；

●  冻干疫苗脱水彻底，含水量低，重量轻，适合长途运输及长期保存；

●   冻干疫苗可以在室温下保存，减少冷链运输的成本，延长货架期。

2、冻干疫苗所面临的挑战

冻干疫苗具有显著的优势，但必须克服一些挑战。

复杂的制剂，尤其是由多种菌株或多种抗原组成的疫苗，可能导致具有挑战性的关键配方温度和复杂的冷冻干燥过程。冷冻和干燥会对疫苗造成一定的影响，疫苗冻干过程的敏感性程度因疫苗而异。内部结冰和对疫苗成分（例如脂质膜、核酸或蛋白质）的直接损害可能是应力因素。

在冷冻过程中会形成病毒内冰晶，这会增加产品的体积并可能损坏脂质双层（如图3 所示）。冰还会在冰和液体之间产生新的界面，并增加表面诱导聚集的风险。

                                                                                                  图3：冷冻干燥过程中的应力因素

在关键配方温度以上干燥会导致无定形相在冻干循环的初级干燥步骤中的流动性提高。这使得蛋白质相互作用并可以提高膜通透性。

在去除结合水的二次干燥阶段，可能会发生蛋白质聚集和失活。在磷脂存在的情况下，热致相变的改变也可以提高膜渗透性。二次干燥直接影响残留水分含量，从而影响长期稳定性。

3、冻干疫苗配方所需特性

最理想的情况是，疫苗须在干燥状态下长期储存和液体状态下至少保持24 小时稳定。为了实现这一目标，必须以适当的配方和工艺开发疫苗。

稳定剂（冷冻或冷冻保护剂）在开发稳定的疫苗配方中起着关键作用。无定形冷冻保护剂，如糖类和糖醇，在冷冻过程中通过优先排除冷冻保护剂和蛋白质的水合作用在热力学上保持稳定（如下图4 所示）。

                                                                                                                 图4：优先排除理论

它们还通过玻璃化作用提供动力学稳定性，从而减缓蛋白质和脂质膜的聚集。一些冷冻保护剂，如葡聚糖，不能渗透化合物，但通过增加渗透梯度，也能够阻止内部结冰。

一些冻干保护剂，如右旋糖酐，不能渗透该化合物，但可以通过增加渗透梯度来抑制内部结冰。冻干保护剂通过替换水和磷脂或蛋白质之间的氢键，在冷冻干燥循环的干燥阶段发挥作用(如图5所示)。与冻干保护剂一样，通过玻璃化来实现动力学稳定，使蛋白质和脂质膜的流动性得以实现，从而达到结构和构象的稳定。

                                                                                                              图5：水替代理论

为了提高疫苗的稳定性，可以在制剂中加入其他赋形剂，例如缓冲剂、使表面引起的不稳定最小化的表面活性剂和不太常用的赋形剂，例如填充剂、有机共溶剂和张力调节剂。

案例研究——开发一种具有三种灭活血清型的耐热冻干脊髓灰质炎疫苗

通过使用实验设计(DoE) 方法，用多种赋形剂评估了脊髓灰质炎疫苗的不同配方，并检查了血清型的稳定性。用有限量的赋形剂进行基本筛选没有显示出稳定的产品，因此进行了广泛的筛选，成功鉴定了稳定剂。与液体制剂和其他市售脊髓灰质炎疫苗制剂相比，对*候选物进行优化产生了具有高热稳定性的*制剂。

4、冻干疫苗工艺开发

冷冻对产品特性有重要影响，进而影响产品稳定性(如图6所示)。缓慢冷冻会导致形成少量的大晶体，这可能对膜有害。快速冷冻减少了渗透水释放的时间，但是会产生更大的内部结冰风险。快速或慢速冷冻之间的选择是困难的，但会很容易受疫苗配方和敏感性的影响。因此，在冻干循环开发过程中研究冷冻速率对稳定性的影响至关重要。

                                                                                                                     图6：冻结速率的影响

产品温度在整个初级干燥步骤中至关重要，它会影响干燥时间、升华速率和稳定性。在优化疫苗的主要干燥参数时，值得考虑减少干燥时间与产品稳定性的成本效率。

在二次干燥期间去除水合壳会降低产品稳定性。残留水分增加还会导致坍塌、聚集和降解。因此，*残留水分含量和二次干燥条件也应该是开发阶段的一部分。

案例研究——初级干燥过程中产品温度对长期稳定性的重要性

在所检查的细菌疫苗的示例中，基于产品温度(Tp) 测试了三个不同的循环，并在稳定性方面分析了产品特性。通过比较冻干后活细菌疫苗的活细胞计数来量化稳定性。

冷冻干燥后立即保守 [Tp 远低于崩溃温度（Tc ）但高于玻璃化转变温度（Tg ' ）]和激进循环（Tp 高于Tc ）之间没有区别。

激进周期在几天和一个月后表现不佳，中间（Tp 在Tc ）和激进周期不如保守周期好（如图7 所示）。建议使用保守条件开始干燥周期，但对于某些疫苗制剂，高于Tc 的初级干燥可能不会导致稳定性损失。

                                                                       图7：临界配方温度(CFT)与冷冻干燥条件对疫苗稳定性的影响的相关性

那么问题来了

Q1：如何准确实现冻干疫苗中关键配方温度测量？

                                                                                        图8  ：冻干显微镜Lyostat5及搭配使用的DSC模块

英国Biopharma Group公司提供的冻干显微镜Lyostat5及可与显微镜搭配使用的DSC模块，可以轻松实现配方关键温度（Tc, Teu, Tg’)的测量。

Q2：如何快速实现疫苗冻干工艺开发和优化？

SP Scientific提供的Lyostar冻干机仅需运行一个遁环即可自动摸索和开发冻干工艺。结合全球领先的冻干PAT技术（Smart 全自动工艺开发技术，Controlyo晶核控制技术，TDLAS实时水蒸汽测量技术），使漫长复杂的工艺摸索变得简单快捷有效。

                        图9：Lyostar 全智能冻干工艺开发与优化

Q3：是否有冻干疫苗的案例？

辉瑞、莫德纳，阿斯利康、强生均已在使用SP Scientific Lyostar智能工艺开发冻干机进行新冠冻干疫苗的研发。

The Pfizer/BioNTech Comirnaty vaccine, 31 December 2020.

The Moderna COVID-19 vaccine (mRNA 1273), 30 April 2021.

The SII/COVISHIELD and AstraZeneca/AZD1222 vaccines, 16 February 2021.

The Janssen/Ad26.COV 2.S vaccine developed by Johnson & Johnson, 12 March 2021.

灭活疫苗是传统成熟的技术路线。RNA疫苗有效性较高，代表着未来疫苗新技术和新趋势。冷冻干燥是提高疫苗热稳定性的理想技术。冻干疫苗制剂开发应探索冻干保护剂和冷冻保护剂、其他稳定赋形剂的选择以及冻干过程中的冷冻干燥工艺的影响，以防止对疫苗造成任何损害。

在开发项目中，应根据配方和工艺问题考虑对工艺条件的影响，以及它如何影响产品质量属性。通过了解这些潜在机制，结合先进的PAT工具和QbD理论，实现快速合理开发，*获得有效性高、长期稳定性好的预防疫苗和治疗疫苗，快速预防和消除人类疾病！