反相快速制备聚焦梯度优化方法

  摘 要  

在ACCQPrep® HP150 系统使用自动聚焦梯度发生器，人们无需再花时间开发或优化闪式色谱聚焦梯度方法。从单次运行分析侦察的结果，由内置工具自动计算生成聚焦梯度， 以确定是否能够在CombiFlash® NextGen 系统上有效运行特定的纯化，以及制备型 HPLC 的聚焦梯度的计算或闪式色谱的纯化。当使用 RediSep®制备型HPLC色谱柱与 RediSep Gold®相匹配的色谱柱，以确定样品纯化和计算闪式色谱聚焦梯度，在运行时间为7 - 12min内完成（取决于HPLC系统和所使用的色谱柱）。也可以使用分析型 HPLC 系统通过ACCQPrep 聚焦梯度生成器以计算快速色谱梯度（参见Teledyne ISCO 网站上的技术报告TN52）。

背景

反相快速色谱技术由于缺乏方法的快速开发技巧而受到阻碍，正相快速色谱方法的开发可以用薄层色谱 (TLC) 板完成，但如果样品洗脱在超过 60% 的含水溶剂系统，反相薄层板需要很长时间才能完成。另一种手段是直接在闪式色谱系统上开发方法，但这会消耗大量溶剂和样品；或者可以在分析 HPLC 系统开发方法，然后转移到闪式色谱系统，通常涉及多次尝试并且需要相匹配的分析柱和闪式快速色谱柱（如应用报告AN118 中所述）。使用配备RediSep Prep 色谱柱的ACCQPrep制备色谱上的梯度生成器工具，将避免了所有这些问题，不仅节省时间、样品和溶剂，而且对容易纯化的样品还可以使用快速制备系统进行，这将避免大量的分离纯化在高压制备完成而导致ACCQPrep 系统的工作量压力。

实验和结果

使用以下流程开发闪式色谱的聚焦侦察运行梯度。
1、在 ACCQPrep 上运行聚焦梯度生成器，使用待纯化样本进行纯化。使用内置聚焦梯度生成器，或者分析HPLC的聚焦梯度计算工具，如果使用 ACCQPrep 进行侦察运行，则使用流程“a”。流程“b”用于使用 ACCQPrep 校准的 HPLC 系统。
a、使用 20x150 mm Redisep 制备色谱柱计算需纯化的化合物的聚焦梯度。请注意，Redisep 制备色谱柱应与 RediSep 反相色谱柱化学性能相匹配，从而避免色谱柱选择性的差异。记录开始和结束聚焦梯度的点；这些值将用于快速闪式色谱系统。
b、确保 ACCQPrep 和分析HPLC已根据技术说明 TN52 进行校准。
使用 2 x 50 mm 或 4.6x150 mm RedisSep Prep与闪式色谱柱化学性能相匹配的分析色谱柱，例如 RediSep Gold C8，C18 或 C18AQ。输入ACCQPrep 中的目标峰保留时间来计算聚焦梯度。记录开始和结束聚焦梯度的点；这些值将用于快速色谱系统。

2、判断要纯化的化合物与最接近的杂质之间是否有足够的分离度，确定这一点的最简单方法是计算杂质和目标的化合物的聚焦梯度，然后注意每种方法的聚焦梯度起点，如果杂质梯度起始点的溶剂组成与目标化合物相距超过 3% 的B，纯化可以是在闪式色谱柱上运行；否则将需要 ACCQPrep系统。起点梯度溶剂组成值的差别，不因ACCQPrep 使用内部计算或使用外部 HPLC计算工具将是相同的。另一种评估所需的分离度方法取决于侦察梯度中的峰值保留时间的差异。确定侦察梯度斜率 m = (Ending %B – Start%B)/梯度时间。对于图 1 中的示例是 (100-5)/6 = 15.8。因为我们要解析的峰，在快速色谱柱需要达到3%的分离度，将 3 除以斜率，公式为：Δ%B = 3/m。图 1 中为了达到 6 分钟梯度，3/15.8 = 0.19，舍入到≈0.2 分钟。这意味着峰值解析度在侦察梯度至少0.2分钟，可用于CombiFlash NextGen 系统纯化。

3、在CombiFlash NextGen 上加载和侦察运行使用类型相同的色谱柱，使用方法编辑器的创建以柱体积为单位的聚焦梯度，选择和侦察运行相同的溶剂，包括修饰剂，%B 的开头和结尾与聚焦梯度和ACCQPrep 梯度长度，以柱体积为单位，如表 1 所列，当固体上样方式使用时，需要延长梯度时间。

下面的例子使用了辣椒素的混合物，选择达到快速色谱的分离度极限。
第一步是执行侦察运行，确定第一个洗脱峰的梯度在~7.5min时。使用RediSep 制备 20 x150 mm色谱柱 (PN 69-2203-810)用于侦察筛选运行，水/甲醇梯度。

下一步是计算第一个洗脱峰聚焦梯度， 色谱图作为例子。侦察运行的峰值分离为 0.2min，对应于 3%B 的差异计算出两种化合物的梯度。

50 g RediSep Gold C18 色谱柱 (PN 69-2203-336) 加载到 CombiFlash NextGen，之后系统自动识别，并调用此色谱柱运行参数，侦察运行的同样溶剂用于此系统，渐变梯度修改到与ACCQPrep 的溶剂组成具有相同起点和终点的聚焦梯度，该色谱柱在结束时用至少 2.5 CV 的 B 溶剂洗涤运行以清除强保留的化合物。

在 5.5 g Redisep C18 色谱柱上使用相同的梯度范围，但梯度长度更改为20 CV。

结论

仅使用来自用于评估样品纯度的筛选运行的数据，和使用ACCQPrep 内置的聚焦梯度生成器允许在 12min内确定优化闪式色谱的方法，该工具还允许用户提前确定在快速色谱柱上运行目标化合物和最近的杂质之间是否有足够的分离度，或者如果需要更高的分离度，ACCQPrep 是否为必需的；在给定的分离度下，ACCQPrep 计算的梯度可以用于闪式快速纯化；或继续运行ACCQPrep。

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