【ISCO】波段收集技术在CombiFlash®系统中的应用

CombiFlash 系统中波段收集功能能够计算光电二极管阵列检测到的所有波长的平均吸光度。通过对信号进行处理，可以消除由溶剂吸收引起的基线漂移现象。这样便产生了一个单一的图谱或是色谱信号，使得多功能液相色谱或快速色谱系统中的分部收集程序能够精确地收集以纯化产物。在以下情况下，波段检测显得尤为重要：

• 化合物或是分析物光谱未知时，例如从自然产品中提取的化合物。

• 当混合物包含多种不同的吸光度的混合物，单一波长无法识别混合物中所有化合物时。

• 当洗脱溶剂的吸收光谱与所需化合物的吸收光谱重叠时。

• 当具有相似光谱的化合物使检测器过载，从而难以正确分离化合物时。

CombiFlash 系统的波段检测技术显著提升了自动化提纯化合物的能力。以下是几个示例以说明这些技术改进的优势。

图1：色谱图展示了使用二醇柱和波段收集技术提纯的叶绿素 (A)、咖啡因和儿茶素 (B) 以及单宁酸 (C)。这些化合物具有不同的光谱，但都能通过波段收集技术被检测到。

示例2：未知光谱

图2：使用波段收集技术检测儿茶素 (A) 以及咖啡因 (B) 和其他儿茶素类化合物 (C)。

图3：图2中分离的化合物的紫外吸收图谱。

在图 2 中，大部分儿茶素家族化合物不吸收 254nm 波长的紫外线，但波段收集技术却能够成功检测并分离该族化合物。这一技术手段在处理自然产物时显得特别有效，因为在进行最终纯化之前，我们通常无法了解目标化合物的吸光度情况。通常完成分子鉴定之前，我们尚未了解某特定分子的吸光度。波段收集技术特别适纯化吸收光谱未知的化合物，因此此技术在处理天然物显得特别有效。

溶剂光谱与化合物光谱重叠

图4：使用二氯甲烷/甲醇梯度，通过波段收集技术纯化葡萄糖五乙酸酯。

样品过载检测器

在快速色谱中，样品负载过高导致吸光度饱和检测器是常见情况。若化合物洗脱时间相近，这种饱和现象会使得分部收集器无法准确分离化合物，因为饱和峰会被误认为一个大的单一峰。

图5：使用波段收集技术纯化紧密洗脱的饱和峰。

纯化具有相同特性吸收峰的多种化合物

由于波段收集技术的检测范围可以调节， 使用者可以轻松分离出具有特殊吸收波段的那些化合物。这项技术允许仅仅收集我们感兴趣的特定化合物。虽然我们可以选择一个单一波长来完成这项任务，但波段收集技术可以设定一个特定的波长范围，以收集一系列结构相近的化合物。

图 6 单一波长技术可分辨三种吸收 254 紫外光的化合物。而图 7 则展示了利用波段收集技术进行选择性纯化的过程，其中化合物 1 和 3 在 295 nm 至 325 nm 的波长范围内有吸收而化合物 2 不吸收该波段波长。

图7：运用波段收集，在 295 至 325 nm 区间内选择性提纯化合物。

波段收集技术的参数设置位于 CombiFlash 系统的方法编辑器界面。启动波段收集功能后，便可配置检测器的各项参数（参见图8）。可配置的参数包括波长范围（用以滤除溶剂或非目标化合物）、峰宽度、斜率以及阈值。当波长范围包含无吸光度的区域虽然会降低波段收集的灵敏度，但依旧能够实现化合物的收集。

此外，使用波段收集时，建议同时启用一个可以观测到大多数分析物（包含杂质）吸收光谱的单一检测器。

图8：波段收集和单一波长收集的检测参数。

案例1：溶剂在侦测波长范围内无吸收

若选定波长范围内溶剂无吸收，可将峰宽设为最长八分钟。这一设置同样适用于等度洗脱，因基线稳定，即使溶剂吸光度落在波段收集选定范围内，仍适用此设置。图1展示了按此技术进行纯化的情形。

案例2：溶剂在波长范围内有吸收

如溶剂在选定检测器范围内吸收（参见图4），则需将波段收集的峰宽设置为单一波长检测器峰宽的两倍。参见图 8 示例。此参数有助于减少溶剂干扰（参见图9和图10）。

图9：使用庚烷：丙酮梯度在280 nm收集儿茶酚和间苯二酚。基线随着丙酮比例的增加而漂移。

图10：使用波段收集技术在庚烷：丙酮梯度中收集儿茶酚和间苯二酚。波段收集技术过滤掉了大部分基线漂移。