巨噬细胞的分离培养与鉴定

       巨噬细胞是动物机体内重要的免疫细胞， 具有抗肿瘤和免疫调节等重要作用，被广泛应用于体外免疫增强药物的非特异性免疫功能。有很多能从多种组织和器官中分离纯化巨噬细胞，但这些方法大多都是繁琐、复杂，所需时间长且耗资较大。本实验就以小白鼠腹腔巨噬细胞为研究对象， 探索建立一种巨噬细胞体外分离培养与鉴定简便的方法。

      首先选取一只小白鼠，腹腔注射不含小牛血清的rpmi-1640培养液5ml。轻柔小鼠腹部2-3min，静置5-7min后将小鼠颈椎脱臼处死，至于解剖板上，无菌条件下打开腹腔，用注射器抽取腹腔液，离心5min （1000r/min），弃上清，用pbs洗涤2遍。再用含10%成牛血清的rpmi-1640培养液（0.1%双抗溶液）调节至2×106ml-1，接种于培养瓶及6孔板，置5%的CO2培养箱中37℃培养2h，弃上清。用不含小牛血清的rpmi-1640培养液洗涤2遍，然后加含有10%小牛血清的rpmi-1640培养液在37℃，CO2培养箱中继续培养，倒置显微镜观察细胞形态。

     巨噬细胞的观察与鉴定

     然后称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。使用时。用pbs稀释至0.4%。； 胰酶消化贴壁细胞，制备单细胞悬液，并作适当稀释。染色：细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9：1混合混匀；

     在三分钟内，分别计数活细胞和死细胞。镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。

     瑞氏染色计算细胞纯度

     细胞涂片自然干燥后，用蜡笔在两端画线，以防染色时染液外溢。随后将玻片平置于染色架上，滴加染液3-5滴，使其盖满涂片，大约1分钟后，滴加等量的染液，用吸耳球轻轻混匀。冲洗：染色5-10分钟用流水染液，待干， 结果观察，将干燥后的血涂片置显微镜下观察。