高效/超高效液相色谱(UPLC/HPLC)小体积样品选择Whatman滤器的技巧

过滤（Filtration）对于大多数实验室都非常关键，从基础生物学和化学研究到工业应用，如食品加工、生物制药、工业品安全等，同时高效液相色谱样品的体积越来越小。随着“小体积样品”在实验室变得更加普遍，意味着检测精度和操作效率都需要大幅度提升才能满足实际需求。Merck科学家Vivek Joshi认为：“小体积是指几微升样本”，GE产品经理Navin Pathirana认为：“小体积是小至1微升的样本，可能有些学科的定义要严格些。”

对于小体积样品的过滤，这通常涉及组织、单细胞和蛋白组分分析。但是药物研发人员分析小体积样本时，更需要做过滤处理，否则其中的颗粒物和杂质会影响HPLC柱子的性能。因为样品体积越来越小，每天分析的样品量巨大，现在就连一个小规模实验室每天样品分析的量都是惊人的多，Joshi说：“科学家们都在寻找小体积样品过滤的解决方案，让样本制备更简单，更快速”。事实上，小体积样本在提高检测效率的同时，需要极力避免出现任何异常的系统误差，这对高效而可持续的过滤系统提出更高要求。

我们从世界领先的Whatman滤器近100年的发展，可见色谱样品制备方式的巨大变革，如下图。

确保样本分析的精度

HPLC样品的分析精度很大程度上取决于样品制备环节，特别是过滤步骤。这种情况下，研究者不希望将样品损耗于过滤器内，或者有潜在物质从滤器中溶出来。Pathirana说：“如果我们使用一种洁净且专门为HPLC样品过滤的滤器，比如选择一个13mm、含兼容性更佳的Whatman再生纤维素膜的SPARTAN滤器，可将滞留体积减小至几个微升以下，或用一个4mm内含PTFE膜或PVDF膜的Puradisc滤器，确保死体积最小，同时这类经过严格清洗的微型滤器还确保样本无任何污染。”对于高粒相量易堵塞的样品，选择GD/X梯度过滤器可确保高通量。

恰当好处地节约样本

因为过滤的是小体积样品，特别需要注意避免样品损失、滞留或长期挥发，当一个人每天做的样本数量小于10个，使用针头式过滤器时，工作量相对较轻松。如果一个人每天需做几百个样本，那么常需使用一次性的96孔板或384孔板，但样本的长期滞留和挥发则不可避免。如果每天需做10-100个样本，样本数量不够使用多孔板，而针头式滤器则带来超级巨大的工作量。事实上，大约60-70%的研究人员平均每天处理的样品量都在10-100个之间。因此，我们需要一个可以做小体积样品过滤的系统，且恰当好处地节约样本和耗材，同时满足样品分析的需求，“比如Whatman Mini-Uniprep G2是一种非常值得的选择。”Pathirana说。

提高样本过滤的效率        

从HPLC转移至UHPLC，样品过滤步骤则变成“瓶颈”，为什么会这样呢？

运用UHPLC做小体积样本分析更复杂。“从HPLC转移至UHPLC，通常过滤样本并将样本转移至自动进样器的时间，已经相当于上机分析一个样品的时间了，因此成为影响仪器整体效率的“瓶颈”。”Pathirana分析说，“除此之外，UHPLC柱子填料的颗粒尺寸更小了，意味着临界间隙变小，更多需要0.2um,0.1um甚至纳米孔径的滤器才可满足分辨率要求。尽管存在这样的挑战，但UHPLC的普及率却越来越高，这个已经成为了必然趋势。“因为UHPLC具有更高的分辨率、灵敏度和分析速度。”Pathirana说，“为了充分利用UHPLC带来的真正好处，那么样本过滤的效率必须提高，这也是我们着力优化UHPLC工作流程的地方。”如果我们能将“过滤器和自动进样瓶”合为一体，无需针筒、滤头和单独进样瓶，那么这个问题就迎刃而解了！GE医疗生命科学部将这个大胆的想法变成了现实：这便是先前提及的Mini-Uniprep非针式滤器，这是一个革命性的产品。

技术依赖于技巧和实验目的

研发人员使用什么样的滤器，亦可能取决于样品的类型和实验目的。一位来自Arizona州立大学的博士研究生（Oliver Hyman），曾使用一种特殊的滤器来一次过滤60-1000微升的池塘水，目的是从病原体中寻找一种DNA，“我采用一种自己组装的滤器，即运用Win-Lok自组装滤器，通过灵活更换不同孔径滤膜(如Nuclepore径迹蚀刻膜)，它可以让水样选择性地透过这张滤膜而截留病原体。”Hyman说，这种方式似乎也满足了他的需求，“我喜欢这种方式，因为它比那些水样采集设备简单多了”，Hyman补充道，“还可以借助一些工具来设计方案，如泵、预滤器等，或许可以过滤更多水样！”。虽然是来自实验室的小众化需求也不断增加，但我们也需要有效利用尽可能简单而可靠的设备和耗品来实现。

如今，研究者可从许多备选方案中去选择，如专为HPLC/UHPLC样品制备而设计的Mini-Uniprep非针式滤器，高通量的滤器，纳米级的滤器，底本低的滤器等等。Whatman技术专家分析道，中低压液相色谱(FPLC/AKTA)和超高效液相色谱(UHPLC)应采用0.2μm 滤器，高效液相色谱(如色谱柱填料直径5μm或10um)则采用0.45μm滤器，要求更小过滤死体积，采用13mm SPARTAN 或4mm Puradisc 滤器。同时日常需大量使用缓冲液(Buffer)和流动相，去除潜在颗粒物、杂质和细菌及脱除气体，可以消除杂峰，或保护分离柱，建议选用0.2um滤膜或在线过滤脱气滤器IFD（0.2um）。我们建议学者或实验人员参考《Whatman实验室科学产品目录》和《实验室分离过滤技术指南》，如下图。同时需要不时总结实践经验和操作技巧，关键时候还需专业人士的指导。