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乳制品中L-羟脯氨酸的检测

依利特

2011/05/13 09:00

阅读：1776

1 前言

“皮革奶”添加物的主要成分是皮革水解蛋白（即动物皮毛，含大量角质蛋白质），其中劣质水解蛋白的生产原料主要来自制革工厂的边角废料，制革边角废料中含有重铬酸钾和重铬酸钠，用这种原料生产水解蛋白，重铬酸钾和重铬酸钠自然就被带入产品中，被人体吸收。食品专家介绍，皮革水解物主要添加的食品是乳与乳制品及含乳饮料，作用是增加蛋白质含量。

主要检测方法是检查牛奶中是否含有L-羟脯氨酸，这是动物胶原蛋白中的特有成分，在乳酪蛋白中则没有，所以一旦验出，则可认为含有皮革水解蛋白。

本实验提供了乳制品中L-羟脯氨酸的检测方法，采用DNFB柱前衍生法进行分析测定。

2 仪器配置与试剂

2.1 仪器、前处理设备及试剂盒配置

表1 L-羟脯氨酸检测标准配置

序号	名称	订货号
1	P1201 高压二元梯度系统
2	氨基酸分析专用色谱柱	31110091
3	氨基酸专用保护柱
4	氨基酸试剂盒	31990001
5	L-羟脯氨酸标准品

表2 氨基酸试剂盒组分表

序号	名称
1	氨基酸衍生化溶液
2	衍生缓冲固体组分A
3	衍生缓冲固体组分B
4	平衡缓冲固体组分A
5	平衡缓冲固体组分B
6	流动相B固体组分

表3 前处理设备配置

序号	名称
1	恒温水浴锅
2	氮吹仪
3	溶剂过滤装置
4	流动相超声装置
5	烘箱
6	0.45μm针孔式微孔滤膜
7	5mL水解用安瓿瓶
8	封口膜

2.2 其他

25mL棕色容量瓶、50mL棕色容量瓶、移液枪、移液枪枪头、一次性PVC手套、一次性口罩、氮气瓶、2mL塑料离心管、进样针等。

2.3 试剂及相关溶液配制

2.3.1 衍生缓冲溶液

称取衍生缓冲液固体组分A 1.24g，固体组分B 7.63g，加入至500mL量瓶中，定容并摇匀后备用。

2.3.2 平衡缓冲溶液

称取平衡缓冲液固体组分A 0.91g，固体组分B 3.58g，加入至250mL量瓶中，定容并摇匀后备用。

2.3.3 羟脯氨酸标准溶液

将羟脯氨酸标准品用衍生缓冲溶液定容至250mL容量瓶中，备用。

2.3.4 流动相A

乙腈-水（1:1），相同体积的乙腈与水混合，超声脱气10～15min。

2.3.5流动相B

称取流动相B 固体成分4.1g加水约950mL，用冰醋酸调pH至6.4~6.8，加10mL N,N-二甲基甲酰胺，加水定容至1000mL，摇匀后静置片刻，用0.45μm微孔滤膜过滤，超声脱气10～15min。

3 实验方法

3.1 样品水解

准确称取适量样品于5mL安瓿瓶中，精确到0.0001g(使试样中蛋白质含量在10～20mg范围内)，加入3mL 6mol/L盐酸。含水量高的样品如牛奶，可加入等体积的浓盐酸。酒精灯高温拉丝封口,放入烘箱中110℃ 水解24h。水解液氮气吹干，用衍生缓冲溶液多次洗涤安瓿瓶，合并洗涤液转移至25mL容量瓶中，并用衍生缓冲溶液定容，备用。

3.2 衍生方法

3.2.1 样品水解液衍生

取已过滤的样品液10mL至50mL棕色试剂瓶中，加入衍生试剂5mL，混匀。放入60℃水浴中，暗处反应60min。反应完毕，取出冷却至室温，加入平衡缓冲溶液稀释到刻度，静置15min，用0.45μm滤膜过滤，取10μL进样分析。

3.2.2 L-羟脯氨酸标准溶液衍生

移取10.0mL L-羟脯氨酸溶液，加入50mL棕色容量瓶中，再加入5.0mL衍生化溶液。用封口膜封口，放入60℃水浴中，暗处反应60min。取出，冷却至室温，用平衡缓冲溶液稀释至刻度。静置15min，取10μL进样分析。

3.3 色谱条件

色谱柱为依利特公司氨基酸分析专用ODS色谱柱；柱温：27℃；采用二元梯度分析，梯度程序如表1所示；流动相总流量为1.2mL/min；检测波长：360nm；进样体积：10μL。

表1 梯度曲线

时间(min)	流动相A(%)	流动相B(%)
0	16	84
0.3	16	84
4	31	69
9.5	36	64
17	55	45
28	65	35
34	100	0
36	100	0
38	16	84

4 分离谱图

图1 19种氨基酸标准品典型分离谱图

1. Asp 天冬氨酸； 2. Glu 谷氨酸； 3. Hpy 羟脯氨酸；4. Ser 丝氨酸； 5. DNP-OH 2,4-二硝基苯酚； 6. Arg 精氨酸； 7. Gly 甘氨酸； 8. Thr 苏氨酸； 9.Pro 脯氨酸； 10. Ala 丙氨酸； 11. Val 缬氨酸； 12. Met 蛋氨酸； 13.Cys 半胱氨酸； 14. Ile 异亮氨酸； 15. Leu 亮氨酸； 16. Trp 色酸； 17. Phe 苯丙氨酸； 18. His 组氨酸； 19. DNFB 2,4-二硝基苯；20. Lys 赖氨酸；21. Tyr 酪氨酸