动力学与剂量反应曲线的结合解锁更多玩法

近年来，全球范围内生物制药行业发展势头迅猛，在创新药、仿制药领域中涌现出诸多国内公司。尤其在抗体新药研发领域，国内目前已有一百四十余家公司提交了新药申报，包含单抗、双抗、ADC、融合蛋白等多种类型，竞争日趋激烈。在药物研发生产过程中，药物的生物学活性检测，是至关重要且必不可少的一步，其中IC50和EC50是重要的参考指标。

IC50 (Half Maximal Inhibitory Concentration)是指被测量的拮抗剂的半数抑制浓度。它能指示某一药物或者物质(抑制剂)在抑制某些生物过程(或者是包含在此程序中的某些物质，比如酶，细胞受体或是微生物)达到50%时的浓度。

EC50全称为半数最大效应浓度(Concentration for 50 % of Maximal Effect)，简单理解EC50就是引起50%个体有效的药物浓度，通常其值越大越安全。需注意这些指标只反映治疗作用与急性毒性的关系，并不能反映慢性毒性和过敏性。IC50的I，重在Inhibition，只考察对靶点的效应。EC50的E，重在Effect，看的是总体生物学表型。例如：抗癌药EGFR激酶抑制剂的IC50，是指EGFR的磷酸化被抑制一半的剂量，而EC50是指癌细胞的活力被抑制一半的剂量。

说起IC50/EC50的测定，传统的终点法（如ELISA）对于一线的操作者而言可能都是一个头两个大，为什么呢？因为这个实验实在太太太太繁琐易错了。首先，方法建立就需要考察二抗的性能和影响；其次，实操过程中标准品和待测品的梯度稀释和加样过程也会直接影响结果的准确性；最后，经历多次洗涤和孵育，完成荧光信号的读板过程。看完这些是不是已经开始头大了，别慌，稳住，令人崩溃的还在后面呢，读板结束还需要处理看起来“一团乱麻”的数据……

表1 传统方法与BLI方法对比

与终点测定相比Octet® BLI的测定具有几个优势（表1）：免洗、无标记检测可大大缩短实验时间。同时，得益于Octet® BLI强大的软件分析系统，可视化的数据分析过程可大大缩短。由于去除了洗涤步骤，可更容易地测定低亲和力相互作用，并且可确定每个相互作用的实时动力学和亲和力。

Octet® 13.0版本软件全新推出了“Dose Response”软件模块，可使用当前用于定量和动力学测定的相同测定模式轻松地分析IC50/EC50相似性，快速地评估药物的相对效价 （图1）。在研发及QC实践中，对同一个样品进行测试，结果的均一性至关重要。IC50/EC50实验有着梯度稀释加样步骤，加样的精确度，最终会影响得到的数据精确度。Octet® BLI分析软件可添加编组信息，同步分析得到平行样品间的偏差。这不仅降低了实验成本，更重要的是节约了时间成本，这对于分秒必争的药物研发而言，早上市一天就意味着早一天打开市场。

图1Octet®平台中的剂量反应实验流程

下面浅举一例，展示一下新版本Octet® BLI  分析软件的强大功能。

对于抗体开发，评估抗原结合是一个关键步骤，并且准确检测结合变化的能力至关重要。在适合于评估两种未知抗对照标准品抗体的设置中：以标准两步剂量反应测定形式使用Octet® R8 8通道BLI系统和AHC2生物传感器（18-5142）。使用抗hIgG Fab检测步骤（5 µg/mL）检测12个稀释浓度系列（50~0.02 g/mL）的人源性IgG（hIgG）对照样品。然后，使用正或负30% hIgG浓度系列（分别为65~0.03 g/mL和35~0.01 g/mL）重复测定，并使用Octet® Analysis Studio剂量反应模块分析数据（图2）。

最后，使用4 PL方程评估所有曲线，并根据对照标准品系列进行归一化。每个浓度系列均显示每个数据集的R2值>0.99，并且与对照标准品相比，每个系列的EC50比值比较显示，正或负30% hIgG浓度系列的相似性评分为1.34分和0.74分，与预测值非常一致。结合Octet® Analysis Studio剂量反应模块，保证用户准确地评估多种抗体的抗原结合情况。

图2人源性IgG抗体样品的相对效价的测定

新版本Octet® BLI Analysis Studio软件与以前版本的软件生成的数据完全兼容，因而可快速评估以前生成的数据和新数据，而无需将数据导出到第三方软件。在Octet® BLI系统上，实时、无标记的相对效价测定现在比以往任何时候都更简单，这意味着洗涤和孵育步骤长且动手时间长的费力终点测定将成为过去。